氨茶碱对慢阻肺模型大鼠炎症因子及免疫功能的影响

陈天明，卢 青，李仁翔*

氨茶碱对慢阻肺模型大鼠炎症因子及免疫功能的影响

陈天明1，卢 青2，李仁翔1*

目的 探讨氨茶碱缓解慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠炎症状态及改善机体免疫功能的有效性。方法 随机从60只大鼠中选出20只作为正常组，其余大鼠使用香烟烟雾和细菌联合诱导建立COPD模型。将34只成功建立COPD模型的大鼠随机分为氨茶碱组(17只)和阴性组(17只)。对照组和阴性组每天灌胃生理盐水(2 mL/只，bid)，氨茶碱组每天灌胃氨茶碱[2.3 mg/(kg·d)，bid]。连续灌胃2个月后，进行形态学检测，并进行支气管肺泡灌洗液的炎症因子检测和免疫细胞计数。结果 与正常组比较，阴性组和氨茶碱组支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)，氨茶碱组上述指标低于阴性组(P<0.05)。与正常组比较，阴性组和氨茶碱组支气管肺泡灌洗液中总细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数均升高(P<0.05)，并且氨茶碱组的上述指标水平低于阴性组(P<0.05)。结论 氨茶碱能有效减轻COPD大鼠炎症状态，改善机体免疫功能。

慢性阻塞性肺疾病；大鼠；氨茶碱；炎症；免疫功能

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种具有气流受限特征的肺部疾病，气流受限不完全引起肺功能进行性减退，严重威胁患者生命安全[1-2]。目前，世界尚无有效手段治愈COPD，临床治疗COPD主要通过提高患者的免疫力和减轻气道炎症反应，降低肺部感染和控制疾病损害。氨茶碱(Aminophylline)为茶碱与乙二胺复盐，可松弛支气管平滑肌，增强膈肌收缩力，尤其在COPD时作用更显著，有益于改善呼吸功能[3-4]。目前氨茶碱用于治疗COPD已有十几年的历史，然而关于其作用机制尚不清楚，有关研究发现，其在治疗COPD时，会对机体的免疫功能和气道的炎症状态产生影响[5]。因此，本研究拟通过建立COPD大鼠模型，旨在进一步观察氨茶碱对其免疫细胞和炎症因子的影响，探讨氨茶碱对COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只清洁级SD大鼠，雌雄各半，2月龄，无特定病原体，体重(200±20)g，购于武汉大学动物实验中心，许可证号：SCXK[鄂]2008-0004。实验前，大鼠于独立通风笼适应性饲养7 d，正常饮水、进食，饲养环境温度为25 ℃，相对湿度为55%。

1.2 实验药物和试剂 氨茶碱片(山西鑫煜制药有限公司，批准文号：国药准字H14021214，规格0.1 g)，白细胞介素1β (IL-1β)、白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)。酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，黄鹤楼香烟(湖北中烟工业有限责任公司，含焦油10 mg、尼古丁1.0 mg、CO 11 mg)。肺炎克雷伯杆菌(菌株：CMCC 46114-8)购自武汉省临床检验中心，临用前用生理盐水配成6×108CFU/mL。

1.3 实验仪器 日立7020全自动生化分析仪购于日本HITACHI公司，DM4000B正置生物显微镜购于德国Leica公司，Elx800-UV酶标仪购于Bio-tek公司，Editormp601胸部X光片购于德国西门子公司。

1.4 动物分组及模型制作 随机从60只大鼠中选出20只作为正常组，其余大鼠建立COPD模型。COPD模型建立采用香烟烟雾和细菌暴露法[6]：将大鼠置于自制的熏箱中，每天完全暴露于烟雾中持续3个月，前2周每天点燃6支烟制造烟雾(早、晚各3支)，第3周至第12周每天点燃15支烟制造烟雾(早、中、晚各5支)。此外，在前8周每隔5 d向大鼠两个鼻孔中缓慢滴入新配制的肺炎克雷伯杆菌溶液0.1 mL。12周后通过胸部X光片进行评估，出现明显增厚肺组织和阴影形态不规则表明COPD模型建立成功。将34只成功建立COPD模型大鼠随机分为氨茶碱组和阴性组，每组17只。

1.5 药物干预 成功建立COPD模型后，对照组和阴性组每天灌胃生理盐水(2 mL/只，bid)，氨茶碱组每天灌胃氨茶碱[2.3 mg/(kg·d)，bid]。每周根据大鼠体重调整剂量，连续灌胃2个月后处死大鼠，进行以下实验。

1.6 形态学检测 取大鼠右肺中下叶组织以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，进行HE染色。

1.7 支气管肺泡灌洗液炎症因子测量和免疫细胞计数 在麻醉下，对各组大鼠进行开胸手术，向支气管注入生理盐水进行灌洗，然后回收灌洗液，每次5 mL，重复进行5次。将收集的支气管肺泡灌洗液离心后，取上清液采用ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-6和TNF-α含量，取沉淀进行瑞氏染色，根据细胞形态进行分类，并对总细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞进行计数。

2 结果

2.1 各组大鼠胸部X线片观察 如图1所示，正常组大鼠肺结构完整；阴性组大鼠出现严重的肺组织病理学变化，如增厚无序、高密度斑块、多云阴影和右肺下叶的边缘模糊；氨茶碱组较阴性组炎症症状明显减轻，没有明显的大量渗透。

2.2 各组大鼠肺组织病理态学变化 如图2所示，正常组大鼠肺泡结构完整，未见管壁增厚，纤毛无脱落且排列整齐，未见炎症细胞浸润；阴性组大鼠显示严重的病理变化，如肺泡隔明显增厚、细支气管狭窄，肺泡腔膨胀，肺泡破坏，炎症细胞浸润和黏膜增生；氨茶碱组病变较阴性组明显好转，部分肺泡融合，上皮细胞少量脱落，有较少炎症细胞浸润。

图1 各组大鼠胸部X线片观察

图2 各组大鼠肺组织病理学变化(HE，50×)

2.3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中炎症因子比较 与正常组相比，阴性组和氨茶碱组支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)，且氨茶碱组低于阴性组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠炎症因子水平比较

注：t1、P1：阴性组与正常组比较;t2、P2：氨茶碱组与正常组比较;t3、P3：阴性组与氨茶碱组比较

2.4 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中免疫细胞比较 与正常组相比，阴性组和氨茶碱组支气管肺泡灌洗液中总细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数均显著提高(P<0.05)，并且氨茶碱组低于阴性组(P<0.05)。见表2。

3 讨论

COPD实质是一种慢性气道炎症性疾病，炎症细胞浸润刺激大量的炎性介质释放，引起黏液分泌增加，同时出现免疫功能异常，尤其是免疫细胞功能紊乱[7-8]。近年来，已有大量研究证实香烟烟雾诱导是建立COPD实验模型的良好方法，如Lee等[9]和Wang等[10]研究发现，大鼠完全暴露于香烟烟雾中2个月，会引起肺泡合并和支气管壁增厚，表明香烟诱导的COPD模型建立成功。本研究使用香烟烟雾和细菌联合诱导建立COPD大鼠模型，一方面基于约90%的COPD病例是由于烟雾和细菌感染诱发所致，另一方面是因为该模型表现出类似于人的生理效应，适用于评估药物对肺部炎症的影响。目前已证实烟雾暴露的大鼠伴有支气管炎、肺气肿、气流阻塞、肺泡合并和支气管壁增厚等症状，进而引起气道阻力增加，肺动态顺应性下降，最终增大肺部空气的滞留和减少呼气期间的肺反冲，出现COPD[11]。

表2 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中免疫细胞比较

注：t1、P1：阴性组与正常组比较;t2、P2：氨茶碱组与正常组比较;t3、P3：阴性组与氨茶碱组比较

氨茶碱是临床用于治疗COPD的常用药物，但是目前尚无可靠的临床数据证实其能抑制肺部炎症及改善机体免疫功能。COPD病理变化经常发生在气道壁和肺实质。在COPD大鼠中，胸部X线片观察到肺实质存在明显的炎症，包括增厚无序、高密度斑块、多云阴影和右肺下叶的边缘模糊。氨茶碱组大鼠经氨茶碱治疗后，这些病理变化明显减轻，此外，HE染色显示部分肺泡融合，上皮细胞少量脱落，有较少炎症细胞浸润。

近年研究发现，香烟烟雾诱导的肺炎症反应涉及多种细胞因子和趋化因子。Gessner等[12]发现，烟雾诱导的小鼠肺组织中TNF-α较正常小鼠高表达；Ferrari等[13]发现，COPD患者和健康吸烟人群的血清和痰中IL-6水平高于非吸烟者。TNF-α可通过刺激介导创伤诱导的炎症细胞因子如IL-4、IL-6释放，最终导致组织和器官出现严重的炎症性病变。IL-1β参与炎症介质和效应细胞组成的支气管腔内自分泌环路，Pauwels等[14]研究发现，IL-1β是香烟烟雾诱导COPD小鼠肺部炎症的重要介质。本研究结果显示，阴性组和氨茶碱组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均高于正常组，且氨茶碱组低于阴性组，提示经氨茶碱治疗后COPD大鼠炎症因子明显降低，其抗炎作用可能与抑制磷酸二脂酶活性、神经肽的释放、氧自由基等有关。

研究发现，随着COPD继续发展，炎症向纵深扩展，免疫细胞数量之间的平衡遭到破坏，引起肺自身产生异常的免疫应答，引起肺损伤，进而出现肺气肿。Reddy等[15]研究发现，香烟烟雾诱导的肺炎症反应的可能机制为烟雾刺激肺泡巨噬细胞释放大量中性粒细胞趋化因子，进而引起免疫功能降低。因此，免疫细胞数量增多是COPD特征性免疫反应。本研究中，阴性组和氨茶碱组支气管肺泡灌洗液中免疫细胞数均显著高于正常组，并且氨茶碱组的免疫细胞数显著低于阴性组，提示氨茶碱能在一定程度上调节COPD大鼠肺部免疫细胞数量，从而抑制异常炎症反应。

综上所述，氨茶碱能有效减轻COPD大鼠肺实质和气道壁的炎症反应，其抗炎作用可能与抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子释放和改善机体免疫功能有关，但具体的作用机制仍需分子生物学研究去证实。

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Effects of aminophylline on inflammatory cytokines and immune function of rats with chronic obstructive pulmonary disease

CHEN Tian-ming1,LU Qing2,LI Ren-xiang1*

(1.Department of Respiratory,Jingmen First People′s Hospital of Hubei,Jingmen 448000,China;2.Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

Objective To discuss the effects of aminophylline on the inflammatory state and immune function of COPD rat model.Methods Twenty rats were randomly selected from 60 rats as normal group,and the other rats were established as COPD model by combining of cigarette smoking with bacteria.Thirty-four COPD rats were randomly divided into aminophylline group (n=17) and negative group (n=17).Control group and the negative group were given normal saline (2 mL/d,bid),and aminophylline group was given aminophylline [2.3 mg/(kg·d),bid].The rats were sacrificed at the end of 2 months,and lung tissue histology and ultrastructure was observed under light and electron microscopes.Results The levels of IL-6,IL-1β and TNF-α of bronchoalveolar lavage fluid in negative group and aminophylline group were higher than those of normal group (P<0.05),and the indexes of aminophylline group were lower than those of negative group (P<0.05).The percentage of total cells,monocytes/macrophages,lymphocytes and neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid of negative group and aminophylline group were higher than those of normal group (P<0.05),and the indexes of aminophylline group were lower than those of negative group (P<0.05).Conclusion Aminophylline can effectively improve the inflammatory state of COPD rats and improve the immune function.

Chronic obstructive pulmonary disease;Rat;Aminophylline;Inflammation;Immune function

2017-02-21

1.湖北省荆门市第一人民医院呼吸科，湖北 荆门 448000；2.荆楚理工学院，湖北 荆门 448000

卫计委科研立项项目(WJ2015MB280)

10.14053/j.cnki.ppcr.201708003

*通信作者