超高效液相色谱质谱联用法测定山野菜中5种农药的残留

符 群,赵红华,刘 峰,任红波,魏俊青,陈国峰

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所,农业部农产品质量安全风险评估实验室(哈尔滨),黑龙江哈尔滨 150086)

符 群1,赵红华1,刘 峰2,任红波2,魏俊青2,陈国峰2

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所,农业部农产品质量安全风险评估实验室(哈尔滨),黑龙江哈尔滨 150086)

建立超高效液相色谱-质谱联用法[ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S]测定人工栽培山野菜中啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑5种农药残留。以乙腈为提取溶剂,采用多重反应离子监测(MRM)模式,ACQUITY UPLC BEH C18为分析色谱柱、0.1%甲酸乙酸铵-乙腈为流动相,对样品进行检测分析。结果表明:5种农药在0.0005～2.0000 mg/L范围内与峰面积呈良好线性关系,相关系数在0.9947～0.9999之间。在农药混合标准溶液0.005～0.200 mg/kg的水平下,添加回收率均在73.43%～115.84%之间,相对标准偏差为2.04%～18.19%。检出限在0.020～0.510 μg/kg范围内;定量限在0.066～1.699 μg/kg范围内。本方法操作简单、快捷、准确度和精密度高,可应用于山野菜中5种农药残留测定。

超高效液相色谱-质谱,山野菜,农药残留,检测

我国地域广阔,山野菜种类繁多,其中辽阔的山丘和平原是山野菜的主要产区。目前,随着人们生活水平逐渐提高,饮食结构不断改变,山野菜的需求量日益增加,野生山菜已渐渐不能满足人们的需求。因此,山野菜的人工种植产业具有广阔的发展前景[1-2]。山野菜具有很高的营养价值,还具有“医食同源”得天独厚的优势,具有多种人类需要的矿物质和微量元素及能够预防和治疗多种疾病。山野菜在生长过程中常见有霜霉病、灰霉病、枯萎病、白粉病等病害和蚜虫等虫害。其病虫害主要发生在多阴雨的春季,然而大棚、春播露地蔬菜容易发生霜霉病、灰霉病等病害;干旱少雨季节容易发生白粉病和蚜虫危害;雨过天晴或高温天气,枯萎病发生较为严重[3-4]。嘧霉胺等5种农药对上述病虫害有较好的防治效果,但对于嘧霉胺等5种农药在山野菜中产生的农药残留问题鲜有报道。

目前,国内外文献报道啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑这5种农药残留检测方法主要有气相色谱-质谱法[5-9]、气相色谱法[10-13]、液相色谱-质谱法等[14-18]、液相色谱法[19-22]。其中气相色谱法易受杂质干扰,检测耗时长、灵敏度低。液相色谱法前处理采用固相萃取技术进行净化,操作繁琐、耗时长,且有机溶剂使用量较大,易造成环境二次污染[23]。因此,为达到样品分析速度快、操作简单、灵敏度高和抗干扰能力强的目的,选取较优的提取方法和分析手段尤为重要。近年来常用的色谱分析检测手段―超高效液相色谱-质谱联用技术测定山野菜中农药残留,增加了定性和定量的可靠性,不仅能够实现多种农药残留的同时测定,而且能够对其结构进行确证[24-26]。

根据山野菜部位和器官的不同,苦菜、蒲公英、马齿苋均属于叶菜类较为常见的蔬菜[27]。山野菜中苦菜和蒲公英都属于菊科植物,多年生草本植物,药食兼具的特点,也越来越受人们的欢迎。马齿苋属于马齿苋科,一年生草本,药食兼具、可作兽药和饲料等特点。为了保证种植山野菜的产量,在栽培过程中要使用防治病虫害农药。因此本实验建立超高效液相色谱-质谱联用法[ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S]为测定山野菜中啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑这5种农药残留提供一种检测方法。本文对提取技术、色谱条件和方法作出了探讨分析,应用该方法分析山野菜中啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑这5种农药残留,具有操作简单、快捷、准确度和精密度高等优点,满足了日常检测的需求,具有较高的实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦菜 市售;蒲公英、马齿苋 由肇东市农作物种植专业合作社提供。

啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺和苯醚甲环唑标准品(纯度≥99%) 由农业部环境质量监督检验测试中心(天津)提供;乙腈、甲醇、甲酸和乙酸铵(色谱纯) 美国Fisher公司;N-丙基乙二胺键合固相吸附材料(primary secondary amine,PSA) 天津Agela。

TXB622L电子天平 日本岛津;超纯水机 韩国HUMAN UP 900;FP3010食品搅拌机 德国博朗公司;T25高速匀浆机 德国IKA公司;CF 16RX高速冷冻离心机 日立;Z323K离心机 德国HERMLE公司;VORTEX Genius 3漩涡振荡器 德国IKA;ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S超高效液相色谱/三重四极杆质谱联用仪 美国Waters公司;ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm,2.1×100 mm)美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准溶液的配制:将啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑标准品,分别用甲醇溶解配制成浓度为100 μg/mL的标准储备液,再以甲醇配成质量浓度分别为10 μg/mL(啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑)的混合标准溶液,于-18 ℃下避光保存。上机混合标准溶液:用甲醇溶液或者空白基质稀释到0.0005、0.0010、0.0050、0.0100、0.0500、0.1000、0.2000、0.5000、1.0000、2.0000 mg/L作为标准工作溶液,临用前现配现用。

1.2.2 样品前处理 按GB/T 8855将蒲公英、苦菜、马齿苋样品,取可食部分,将其切碎,充分混匀放入食品搅拌机中,制成待测样品。称取10 g样品到烧杯中,并准确加入10 mL乙腈,高速匀浆2 min,过滤后收集于装有5 g NaCl的离心管中(NaCl使用前140 ℃烘烤4 h),振荡2 min,5000 r/min离心5 min,待乙腈相和水相完全分层。

净化:准确移取1 mL待净化的上清液加入到盛有50 mg PSA的2 mL离心管中,旋涡30 s,5000 r/min离心5 min取上清液过0.22 μm微孔滤膜转入进样小瓶中,待测。

1.2.3 色谱条件

1.2.3.1 超高效液相色谱条件 流速:0.250 mL·min-1,柱温:35 ℃;色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1×100 mm),进样量:2 μL;流动相:A(乙腈),B(0.1%甲酸-5 mmol乙酸铵水溶液);液相色谱梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution parameters

1.2.3.2 质谱条件 电喷雾三重四极杆串联质谱,正离子(electrospray ionization,ESI)模式;毛细管电压:3.0 kV;锥孔电压:10 V;离子源温度:150 ℃;脱溶剂温度:450 ℃;脱溶剂气流量:1000 L/Hr;碰撞气流量:0.15 mL/min;锥孔气流量:150 L/Hr。

五种农药质谱检测参数详见表2。

表2 栽培山野菜中五种添加物的质谱检测参数Table 2 LC-MS/MS parameters for the five additive samples from the wild vegetable

注：*定量离子。

2 结果与分析

2.1 样品提取剂的优化

分别选用丙酮、甲醇、乙酸乙酯和乙腈作提取溶剂进行比较。在蒲公英、苦菜和马齿苋样品中添加啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑后分别用四种溶剂进行提取,实验结果表明:丙酮的提取率高,但其检测结果杂质多,避免出现干扰需多重净化,同时丙酮与水完全混溶,根本不能完全分离,影响最终结果的测定,因此不选择丙酮作提取溶剂。甲醇和乙酸乙酯提取率不理想,甲醇提取范围较广,质谱测定的基质影响较大,乙酸乙酯的极性较小,后续处理中挥发近干消耗时间长,所以不选择甲醇和乙酸乙酯作提取溶剂;而乙腈在提取效率、净化等方面均表现出较好的提取效果,基质干扰较小,操作准确度、灵敏度、精确度均满足残留分析要求。因此选用乙腈作提取溶剂如图1得出。

图1 四种溶剂的提取效果比较Fig.1 Comparison of the effectiveness of four different extraction solvents

2.2 色谱及质谱条件的选择

啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑这五种物质极性不同,因此采取梯度洗脱的方式进行实验。本文分别对水-乙腈、乙酸铵水溶液-乙腈、甲酸水溶液-乙腈和含有甲酸乙酸铵水溶液-乙腈进行对比,水-乙腈色谱峰分离效果不好、峰型欠佳,乙酸铵水溶液-乙腈、甲酸水溶液-乙腈两种流动相灵敏度低、保留时间不稳定、出现拖尾现象。结果采用甲酸乙酸铵水溶液-乙腈的流动相农药之间的峰型可获得最优的色谱分离效果,保留时间稳定,灵敏度高,无拖尾现象(原因可能是乙酸铵具有增强离子效应,可以改善各化合物峰型)。与GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》对比,在梯度条件下进行分析,本实验方法在8 min内,并采用质谱ESI+电离方式采集啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑残留的定性与定量检测。该方法操作简单、快捷、且试剂消耗较少。

图2 五种混合标准溶液农药质谱总离子流图Fig.2 Mass spectrometry total ion chromatogarms of five mixed standard solutions

图3 五种农药的提取离子扫描质谱图Fig.3 The extract ion mass spectrum of five kinds of pesticide residues in wild vegetables

农药混合标准溶液的总离子流色谱图见图2,多反应监测色谱图见图3。由图3可知,各待测化合物能够得到很好的分离,所以液相色谱和质谱条件的选择尤其重要,本文所选的液相色谱和质谱条件分析时间快、色谱峰分离度效果好、保留时间稳定、具有较好的重现性,适用于多种农药残留快速分析。

2.3 基质效应、线性相关性

基质效应:分别用苦菜、蒲公英、马齿苋空白样品经过乙腈提取、PSA净化前处理过程,得到空白基质提取液,但基质效应在农药残留分析中比较普遍,样品本身产生抑制或增益效应使得样品回收率有所偏差,因此,本实验分别用甲醇溶液和空白样品溶液稀释标准溶液,进行超高效液相色谱-质谱联用法对比分析。结果表明:啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑的基质标样峰面积较甲醇溶液标样的峰面积大,说明基质对啶虫脒等5种农药存在一定的电离增强作用。所以为了准确定量,在实际样品测试中,应采用空白基质提取液配制标样以消除基质效应。

线性相关性:分别吸取一定量的啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑标准储备液,配制成质量浓度为0.0005、0.001、0.005、0.05、0.50 μg/mL和0.0005、0.005、0.01、0.50、2.00 μg/mL和0.0005、0.005、0.01、0.10、1.00 μg/mL和0.001、0.01、0.05、0.10、0.50 μg/mL和0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL的系列混合标准工作溶液,按照1.2.3中液相色谱和质谱方法条件进行检测分析。监测色谱峰响应强度为Y对其质量浓度X绘制标准曲线,进样量为2 μL,标准溶液谱图见图2所示。以外标法定量分析结果表明:在线性范围内,啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑监测色谱峰响应强度为Y与质量浓度X之间呈良好的线性关系,其中相关系数R2均不低于0.9947。得到5种化合物农药的线性方程和相关系数,如表3。说明本法适用于啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺和苯醚甲环唑农药残留的定量分析。

表3 标准曲线及相关系数Table 3 Standard curves with correlation coefficients as well as range of linearity

2.4 精密度和方法回收实验

称取10 g制备好的蒲公英、苦菜和马齿苋样品置于烧杯中,分别添加啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、苯醚甲环唑0.02、0.1和0.2 mg/kg,嘧霉胺0.005,0.05和0.2 mg/kg的混合标准溶液进行加标实验,准确吸取混合标准溶液,每个浓度水平重复6次实验,经前期处理之后,按照上文液相色谱条件及质谱条件进行测定分析,从结果可以看出该方法对蒲公英、苦菜和马齿苋三个样品,五种药物的水平添加回收率均在73.43%～115.84%之间,相对标准偏差(RSD)在2.04%～18.19%之间。如表4所示。采用本实验方法的准确度和精密度均符合NY/T 788-2004《农药残留实验准则》的要求,所得数据能够满足实际样品的残留检测要求。

表4 五种农药在三种山野菜中的添加回收率和相对标准偏差(n=6)Table 4 The spiked recoveries and relation standard deviation of the five prsticides in three wild vegetables(n=6)

2.5 检测限与定量限

通过在基质空白提取液中添加标准溶液的方式,确定啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑分别在蒲公英、苦菜、马齿苋中的检出限(LOD)(以S/N≥3计)为0.020～0.510 μg/kg范围内,定量限(LOQ)(以S/N≥10计)均为0.066～1.699 μg/kg范围内。

2.6 实样分析

实验选取市售苦菜和由肇东市甜嫂农作物种植专业合作社提供的蒲公英和马齿苋作为样品,分别按上述方法对样品进行检测分析,结果表明3种栽培山野菜均未检出吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、嘧霉胺和苯醚甲环唑残留。

3 结论

本文通过乙腈和PSA分散剂对啶虫脒、吡虫啉、多菌灵、嘧霉胺、苯醚甲环唑进行同时快速提取和净化,并用超高效液相色谱-质谱联用法对五种农药进行检测。前处理方法操作快捷,每次前处理耗时2 h,可同时处理样品18个左右。实验结果表明,五种化合物的加标回收验证方法的平均回收率在73.43%～115.84%之间;重复实验的相对标准偏差(RSD)为2.04%～18.19%。方法检出限在0.020～0.510 μg/kg范围内;方法定量限在0.066～1.699 μg/kg范围内。

综上所述,采用超高效液相色谱-质谱联用法具有操作简单、快捷、准确度和精密度高等优点。该方法不仅能够满足现行农产品中5种农药残留的分析要求,而且适用于短时间内同时检测栽培山野菜中农药残留。

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Determination of five pesticides residues in wild vegetables by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

FU Qun1,ZHAO Hong-hua1,LIU Feng2,REN Hong-bo2,WEI Jun-qing2,CHEN Guo-feng2

(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China; 2.Agricultural Products Safety Risk Assessment Laboratory(Harbin),Ministry of Agriculture,Safety and Quality Institute of Agricultural products,Heilongjiang Acadamy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

A method was established for determining acetamiprid,imidacloprid,carbendazim,pyrimethanil,difenoconazole residues in wild vegetables by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry(ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S). Residues in samples were extracted with acetonitrile,and separated by C18column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and 0.1%formic acid ammonium acetate and detected. The results showed the linear range of 0.0005～2.0000 mg/L with the correlation coefficients from 0.9947 to 0.9999. The recoveries rates at 0.005～0.200 mg/kg levels were in the range of 73.43%～115.84%. The relative standard deviation(RSD)was 2.04%～18.19%. The limits of detection were 0.020～0.510 μg/kg and the limits of quantitation were 0.066～1.699 μg/kg. The method proved to be simple,sensitive,rapid,accurate and precise for the determination of five kinds of pesticide residues in wild vegetables.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);wild vegetable;pesticide residue;determination

2017-01-20

符群(1974-),女,博士,高级工程师,研究方向:天然产物活性研究与分析,E-mail:nefufuqun@163.com。

2016全国粮油蔬菜质量安全风险评估项目(GJFP20160010002)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)15-0238-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.044