膝眼穴针灸对大鼠膝关节软骨细胞表型以及PGC-1α信号通路的影响

苗岩松,徐卿荣,李 鹤,姚菊芳,董宇启

·实验与临床·

膝眼穴针灸对大鼠膝关节软骨细胞表型以及PGC-1α信号通路的影响

苗岩松,徐卿荣,李 鹤,姚菊芳,董宇启

目的 研究膝眼穴针灸疗法对膝关节软骨细胞表型改变及其参与线粒体生成氧自由基(ROS)的过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(PGC-1α)信号通路变化的影响。方法 通过免疫组化技术检测膝眼穴针灸后大鼠膝关节软骨细胞表型的主要特征分子指标 (col 1、col 2、aggrecan)以及 PGC-1α、线粒体转录因子A(TFAM)、解耦联蛋白2(UCP 2)和NADPH氧化酶1/4(NOX 1/4)因子的表达变化。进一步检测向大鼠膝关节腔内注射ZN005L(PGC-1α激活剂)激活PGC-1α表达后大鼠软骨细胞表型特征分子指标的表达变化，以及软骨细胞内ROS生成量的改变。结果 对大鼠进行膝眼穴针灸后，PGC-1α表达增加；UCP 2以及软骨细胞表型主要指标aggrecan表达下降。激活PGC-1α表达后，软骨细胞内ROS的生成量降低，并且软骨细胞表型丢失现象被抑制。结论 膝眼穴针灸疗法不能改善大鼠膝关节软骨细胞的功能，相反会促进软骨细胞表型特征分子的丢失，并损害软骨细胞功能。

膝眼穴针灸;软骨细胞表型;过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α；线粒体转录因子A；解耦联蛋白2

随着人口老龄化的发展，骨关节炎的发病率呈现逐年升高的趋势[1-2]。而改善软骨细胞表型维持软骨的正常功能，对降低骨关节炎的发病率有重要的影响。Col 1与col 2分别为Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原，正常的关节软骨细胞含有大量col 2及微量col 1，col 2对关节软骨起到防护支撑的作用。Aggrecan为聚集蛋白聚糖，其主要功能是作为结缔组织的纤维成分，与胶原网架结构共同构成一个弹性体，承载压力，传导和缓冲应力，起着保护软骨的作用。软骨细胞表型的丢失，主要表现为col 2和aggrecan表达下降以及col 1表达升高，并且向纤维细胞形态转变[3-5]，导致正常关节软骨功能被破坏。中医认为通过膝关节相关穴位针刺疗法可以使膝关节周围的肌肉松弛，促进血液循环，进而消除膝关节炎症和水肿，使得膝关节粘连症状得以缓解[6]。在国外，针灸对骨关节炎的治疗方式也备受关注。如在德国约有30 000个临床医师应用针灸疗法缓解骨关节炎患者的疼痛感[7], 并且大量研究表明针灸治疗骨关节炎起到了很好的效果[8]。然而针灸疗法对软骨细胞表型的具体影响并不明确。有研究推测，过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(PGC-1α)的表达下降导致线粒体转录因子A(TFAM)表达降低和线粒体功能损害是骨关节炎发生的主要机制之一[9]。解耦联蛋白(UCPs)是一类线粒体内膜上的载体，属于线粒体载体超家族，可以将H+从线粒体内膜渗漏到线粒体基质中，减少ATP的合成并产生热能，即解耦联作用。目前已知的UCP包括 UCP 1、UCP 2、UCP 3、UCP 4、UCP 5等。UCP 2从1997年发现至今其在代谢方面的作用仍处于研究之中，就目前的研究表明，UCP 2在线粒体质子漏调节，减少线粒体氧自由基(ROS)产生，糖脂代谢方面都起到了一定的作用[10]。TFAM下游的UCP 2和NADPH氧化酶1/4(NOX 1/4)是细胞内ROS生成的重要信号因子，而且ROS生成的增加会导致软骨细胞表型的丢失[11]。因此, 本研究通过对大鼠体内膝眼穴针灸，期望明确针灸对软骨细胞表型变化的影响，了解其参与线粒体生成ROS的PGC-1α信号通路的改变。

1 材料与方法

1.1 针灸动物模型制作 选择8只24周龄SD大鼠，无菌级，♀♂不限。每只大鼠随机选择一侧膝关节作为对照组，另一侧作为针灸组。向大鼠膝关节髌骨尖端左右两侧凹陷处进针，每次进针30 min，每10 min运针1次，每周进行2次针灸，持续4周。

1.2 PGC-1α激活模型制作 选择8只24周龄SD大鼠，♀♂不限。每只大鼠随机选择一侧膝关节注射DMSO 10μl作为对照组，另一侧注射浓度为100 mmol/L的PGC-1α激活剂 ZN005L 10μl作为实验组。每周注射1次，持续4周。

1.3 免疫组化技术 将实验大鼠脊椎脱臼法处死后取膝关节软骨。室温下石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，将切片放入 10 mol/L 枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的电炉锅内，锅内的水沸腾开始计时 20 min，进行抗原修复，然后自然冷却到室温。山羊血清(1 ∶10)封闭非特异性染色，室温孵育 15 min；然后分别加入一抗(兔抗鼠)col 1(1 ∶500)、col 2(1 ∶200)和aggrecan(1 ∶500)，4 ℃过夜；PBS 洗涤后加入二抗(羊抗兔，1 ∶1 000)，37 ℃孵育 20 min，再按试剂盒的说明书，链酶亲合素-生物素- 酶复合物法处理，DAB 显色，封片。荧光显微镜下拍照检测。根据免疫组化评分标准(染色细胞数百分比参考分值+染色强度参考分值)进行评分。

表1 免疫组化评分标准

1.4 软骨细胞体外培养 收获SD大鼠膝关节软骨,并进行胰蛋白酶/胶原酶消化分离软骨细胞。用加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液 (Gibco),青霉素/链霉素 (0.1g/L) 和谷氨酰胺 (4.5 mmol) 的培养基进行体外培养。

1.5 细胞流式技术 向培养基中加入ZN005L 100 mmol/L(对照组加入DMSO)作用24 h后消化并收获细胞,调整细胞浓度至(1～10)×109/L，装载探针：加入浓度为10 mmol/L的 DCFH-DA,37℃ 5% CO2培养箱中静置0.5 h，每隔 3～5 min 混匀一下，使探针和细胞充分作用；用无血清的培养基或温暖的PBS液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA；收获各组细胞,上流式细胞仪检测ROS,激发光 488 nm,发射光 525 nm。

2 结果

2.1 针灸后大鼠膝关节软骨细胞表型部分指标结果 与对照组比较，针灸组的大鼠膝关节软骨细胞col 1(图1A、B)和col 2(图1C、D)的表达量并没有发生显著变化；而aggrecan(图1E、F)的表达量发生了下降的趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1G。表明膝眼穴针灸疗法对软骨细胞表型并没有促进作用，反而使得软骨细胞表型出现了丢失的现象。

2.2 针灸后大鼠膝关节软骨细胞中PGC-1α的表达结果 与对照组比较，针灸组的大鼠膝关节软骨细胞内PGC-1α的表达显著增高(图2A、B)，而TFAM(图2C、D)和UCP 2(图3A、B)的表达发生了轻微的降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2E、3G。然而NOX 1/4的表达并没有出现变化(图3C～F)。这表明，虽然膝眼穴针灸的干预使得PGC-1α的表达增加，但是PGC-1α并没有提高线粒体的功能，反而促使TFAM的表达量降低，导致线粒体功能下降，同时UCP 2表达下降造成解耦联作用也受到损害。

图1 膝眼穴针灸后，软骨细胞表型主要指标aggrecan表达降低 Bar=100 μm，*P<0.05

图2 膝眼穴针灸后PGC-1α表达升高，TFAM表达降低 Bar=100 μm,*P<0.05

2.3 激活PGC-1α的表达结果 向培养基内加入ZN005L激活PGC-1α的表达后发现， PGC-1α表达增加后软骨细胞内ROS的生成量降低(图4),并且col 1表达量降低，col 2和aggrecan表达量升高(图5)，差异有统计学意义(P<0.05)。表明激活PGC-1α能够通过降低软骨细胞内ROS的生成量，进而抑制了软骨细胞丢失的现象。

3 讨论

本研究发现，膝眼穴针灸干预并没有保持软骨细胞表型的作用，反而会促进aggrecan表达的降低(图1)。这说明膝眼穴针灸并未有效地改善软骨细胞的功能，相反是破坏了软骨细胞的功能。中医理论中，针灸能够缓解患者疼痛，促进血液循环消除肿胀，这可能说明部分穴位针灸疗法只能改善膝骨关节炎的临床症状，起到缓解的作用，但是并没有从根本上使得软骨细胞功能恢复到正常状态。针灸疗法能够减弱疼痛感，消除肿胀感，但如果长期、反复应用针灸疗法，骨关节炎的症状是否会进一步得到改善还需要长期的观察与随访。

线粒体是ROS生成的主要细胞器。血管内皮发育与体内稳态学的相关研究表明，促进PGC-1α的表达能够降低ROS的生成量[12-13]。本研究结果显示，激活PGC-1α的表达能够降低软骨细胞内ROS生成量，进而抑制软骨细胞表型丢失现象(图4、5)。然而膝眼穴针灸干预后TFAM与UCP 2的表达却发生降低。这表明虽然针灸能够促进PGC-1α的表达，但同时也会使TFAM和UCP 2表达降低(图2、3)。TFAM代表线粒体生物合成功能(如ATP的生成降低)，UCP 2能够通过解偶联作用降低ROS的生成量[14-15]。当进行针灸后TFAM表达量下降意味着线粒体的合成功能受损，UCP 2表达降低意味着线粒体解偶联功能受损。而且有研究显示，在膝骨关节炎患者的软骨细胞中发现线粒体的功能也会发生下降。本研究中膝眼穴针灸干预促使软骨表型部分指标表达下降，这也许和针灸能够导致线粒体功能下降有一定的关系。

图3 膝眼穴针灸后,UCP 2表达降低 Bar=100 μm,*P<0.05

图4 激活PGC-1α的表达后，软骨细胞内ROS生成量降低

图5 激活PGC-1α的表达后软骨细胞表型丢失现象被抑制 Bar=100 μm,*P<0.05

本次研究只探讨了膝眼穴进行针灸疗法后对软骨细胞的影响，并没有研究联合其他穴位所产生的效果，由于动物模型数量有限，选取的针灸模型为成年SD大鼠，如果选择制作关节炎大鼠模型进行针灸实验，那么结果可能更加明显并且意义更加深远。同时此实验缺少临床实验与随访调查使得本次研究具有一定的局限性,这需要在今后进一步完善。

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(接收日期：2017-06-03)

Effect of acupuncture for the knee point on chondrocyte phenotype and PGC-1α signal pathway in knee

MIAOYan-song,XUQing-rong,LIHe,YAOJu-fang,DONGYu-qi

(DeptofOrthopaedics,RenjiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To study the effects of acupuncture for the knee point on the change of chondrocyte phenotype and the peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1 alpha (PGC-1α) signaling pathway involved in mitochondrial oxygen free radical (ROS). Methods The main indicators(col 1，col 2，aggrecan) of chondrocyte phenotype of the rat knee cartilage, PGC-1α, mitochondrial transcriptional factor A (TFAM), uncoupling protein 2(UCP 2) and NADPH oxidase1/4(NOX 1/4) were detected by immunohistochemical technique afer the knee joints of the rats were acupuncture for the knee point. Moreover, after ZN005L was injected into the knee joint of the rat to activate the expression of PGC-1α，the changes of chondrocyte phenotype and ROS were detected. Results The up-regulation of PGC-1α could inhibit the loss of chondrocyte phenotype and reduced the production of ROS. Although acupuncture for the knee point could increase the expression of PGC-1α, it reduced the mitochondrial function and the effect of the coupling,and leaded to the loss of chondrocyte phenotype. Conclusions Acupunture therapy can not improve the function of chondrocytes, on the contrary, it can promote the loss of chondrocyte phenotype and destroy the function of the chondrocytes.

acupuncture for the knee point;chondrocyte phenotype; PGC-1α;TFAM;UCP 2

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.04.046

上海交通大学医学院附属仁济医院骨科,上海 200127

苗岩松,男,硕士生,主要从事膝骨关节炎研究, E-mail:1104782332@qq.com; 徐卿荣,男,博士,主任医师,硕士生导师,通讯作者,主要从事膝骨关节炎研究, E-mail:xuqingro@139.com

R 684.3

A

1008-0287(2017)04-0503-05