微生物发酵法提取米糠粕中可溶性膳食纤维的研究

闵钟熳，贾笑雨，解铁民，周宇朦，巩明娟，许雪，肖志刚*

（沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034）

微生物发酵法提取米糠粕中可溶性膳食纤维的研究

闵钟熳，贾笑雨，解铁民，周宇朦，巩明娟，许雪，肖志刚*

（沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳110034）

以米糠粕为原料，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）B4为发酵菌种，探讨不同条件下微生物发酵法对米糠粕可溶性膳食纤维（SDF）得率的影响。选择时间、温度、接菌量、pH值进行单因素试验，在此基础上进行3因素3水平中心组合设计试验。结果表明，发酵法提取可溶性膳食纤维最佳条件为发酵时间22.4 h、发酵温度35.0℃、接种量6.6%。在此最佳条件下，SDF得率为12.88%，比优化前提高了8.88%，微生物发酵法是一种较好的提取可溶性膳食纤维的方法。

米糠粕；可溶性膳食纤维；发酵；响应面分析

膳食纤维（dietary fiber，DF）通常是指能抗人体小肠的消化吸收而能在大肠被部分或全部发酵的可食用植物性成分（纤维素、半纤维素、木质素等）、碳水化合物及其类似物的总称[1]。其可延缓胃排空时间、控制体质量和减肥，还有降血糖和血胆固醇，预防结肠癌、通便等作用，故营养学家建议摄入适量的膳食纤维[2]。不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）在人体内主要起机械蠕动作用，而可溶性膳食纤维（soluble dieary fibre，SDF）具有较多的生理功能，起到防胆结石、排除有害金属离子、抗糖尿病、降低血脂及胆固醇、防高血压等作用[3]。

目前，膳食纤维的提取方法主要有化学法、酶法、膜分离法、发酵法等，其中微生物发酵法提取膳食纤维有很好的效果[4]。微生物发酵法是提取可溶性膳食纤维的新型技术手段，资源得到了合理利用，实现了微生物产酶与酶解过程的统一，节省了酶制剂在生产过程中的分离纯化工艺，大大降低了生产成本。微生物发酵法不仅提高了可溶性膳食纤维得率，而且为生产高活性膳食纤维提供了有效的途径[5]。

本试验以米糠粕为原料，利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B4，采用单因素结合响应面优化法[6]，研究了微生物发酵法提取米糠粕膳食纤维的工艺参数，旨在提高粕米糠中SDF含量，为SDF的开发利用提供更多的理论依据[7]。对米糠粕资源的利用及可持续发展具有重要的生态和经济效益[8]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）B4：实验室自主分离；米糠粕：市售；体积分数95%乙醇、MgSO4、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4：上海金穗生物科技有限公司；α-淀粉酶（4×104U/g）、蛋白酶（2×102U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（1×105U/g）：北京格林博远生物科技有限公司；种子培养基采用牛肉膏蛋白胨液体培养基[9]。

发酵培养基：取5 g米糠粕粉碎，加入50m L水，121℃灭菌15m in。

1.2 仪器与设备

SLI-700型恒温培养箱、MSL-3780型高压灭菌锅：松下电器（中国）有限公司上海分公司；HZP-250型全温培养振荡器、DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏试验设备有限公司；JSE11E22型离心机：贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；HH-6型数显电子恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠粕处理方法

米糠粕烘干后，粉碎过100目筛，密封储存于阴凉干燥处备用。

1.3.2 菌种的活化

从斜面培养基挑取菌株B4，接种于10m L牛肉膏蛋白胨液体培养基中，封好试管放入恒温培养箱37℃培养12 h。

1.3.3 单因素试验

准确称取米糠粕原料5 g，装入含50m L/250m L水的三角瓶中，分别考察发酵时间、温度、接种量、pH值对SDF得率的影响，各取3次试验平均值。

发酵时间对SDF得率的影响：设定发酵温度为37℃、接种量为4%，分别选取4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h为不同的发酵时间进行试验，发酵结束后，测定SDF得率。

发酵温度对SDF得率的影响：设定发酵时间为24 h、接种量为4%，分别选取30℃、32℃、34℃、36℃、38℃为不同的发酵温度进行试验，发酵结束后，测定SDF得率。

接种量对SDF得率的影响：设定发酵时间为24 h、温度为36℃，分别选取2%、4%、6%、8%、10%为不同的接种量进行试验，发酵结束后，测定SDF得率。

pH值对SDF得率的影响：设定发酵时间为24 h、温度为36℃、接种量6%，分别取5、6、7、8、9不同pH值的发酵液进行试验，发酵结束后，测定SDF得率。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以SDF得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，运用Design Expert8.0软件设计3因素3水平响应面试验[10]，考察发酵时间、发酵温度、接种量及各因素间交互作用对米糠粕SDF得率的影响。

1.3.5 SDF含量测定

表1 米糠粕SDF发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optim ization of SDF in rice bran meal

按照GB 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》[11]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对SDF得率的影响

图1 不同发酵时间对SDF得率的影响Fig.1 Effects of different ferm entation time on SDF yie ld

由图1可知，随着发酵时间的不断延长，SDF得率呈先增加后减少的趋势，在24 h处达到最大值10.9%。令博等[12]对微生物发酵法提取葡萄皮渣膳食纤维的工艺优化及其理化特性研究中也得出相同趋势。SDF得率下降的原因可能是随着发酵时间的增加菌体将营养物质消耗，无法继续提供微生物所需养分；随着发酵时间的增加，培养物中会累积大量有害物质，影响了SDF得率。因此选择发酵时间为24 h。

2.2 发酵温度对SDF得率的影响

图2 不同发酵温度对SDF得率的影响Fig.2 Effects of different fermentation tem perature on SDF yield

由图2可知，SDF得率随着发酵温度的升高呈现先增加后减少的趋势。在发酵温度36℃时SDF得率达到最大值11.2%。SDF得率下降的原因可能是36℃是菌体最适的作用温度，高于或低于此温度都不利于菌体的生长，影响其自身代谢，从而影响对米糠粕的作用效果。因此选择发酵温度为36℃。

2.3 接种量对SDF得率的影响

由图3可知，SDF得率随着接种量的增加呈现先增加后减少的趋势。在接种量6%时SDF得率达到最大值11.8%。SDF得率下降的原因可能是在低接种量时，不能提供足够的活菌使米糠粕完全发酵，随着接种量的增加，活菌数量增大，SDF得率也逐渐提高；当接种量继续增加时，菌体数量过多，消化分解速度加快，造成菌株营养不足和溶氧不足。因此选择接种量为6%。

图3 不同接种量对SDF得率的影响Fig.3 Effects of different inoculum on SDF yield

2.4 pH值对SDF得率的影响

图4 不同pH值对SDF得率的影响Fig.4 Effects of different pH value on SDF yield

由图4可知，SDF得率随着pH的升高呈现先增加后减少的趋势。在pH值为7时SDF得率达到最大值11.9%。SDF得率下降的原因可能与菌体作用的最适pH有关。当偏离最适作用pH时，不利于菌体生长，菌体生长缓慢甚至死亡，从而影响其对米糠粕的作用效果，使SDF得率下降。在pH 6～8时对SDF的得率无明显影响，从环保和产出率角度考虑，pH不作为响应面优化因素。因此选择pH值为7。

2.5 发酵条件响应面法优化试验

由单因素试验结果可知，不同试验因素对米糠粕SDF得率的影响有所不同[13]。可以看出3个因素（发酵温度、发酵时间、接种量）对SDF得率（Y）的影响，为了优化提取SDF最佳条件，以中心组合试验设计原理为依据，并且根据单因素试验结果分析，进行3因素3水平响应面设计分析，设计17次试验，12次为析因试验，5次中心试验，试验设计方案与结果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 米糠粕SDF发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for ferm entation conditions optim ization of SDF in rice bran meal

利用Design-Expert8.0.6软件对表2的数据进行多元回归拟合分析，得到响应面回归方程如下：Y=11.38-0.50A-0.55B+0.58C+0.85AB-0.40AC-0.75BC-1.17A2-1.52B2-1.81C2

表3 回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis of response equation

由表3可知，根据F值可知各个因素对试验结果影响次序为C＞B＞A，即接种量＞发酵温度＞发酵时间。建立的模型P=0.000 4＜0.01，模型显著。失拟项P=0.9566＞0.05，表示纯误差不显著。表明试验误差均是由随机误差造成的，对试验结果造成的不利因素较小。其中二次项A2、B2、C2呈极显著，一次项A、B、C和交互项AB、BC呈显著。说明相关因素对SDF得率影响较大。决定系数R2=0.961 6。表明微生物发酵法提高米糠粕中SDF得率实际值与预测值拟合度较好。校正决定系数R2=0.912 2，表明了该模型中各因素对SDF得率变化情况。综上所述此模型有效，可以来预测分析各因素对米糠粕SDF得率的影响。

2.6 各因素之间的相互作用

图5 发酵时间、发酵温度与接种量交互作用对SDF得率影响的响应面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour line o f effects of interaction between fermentation tim e,temperature and inoculum on SDF yield

由图5可知，接种量较发酵时间和发酵温度曲线陡峭。当接种量一定时，发酵温度较发酵时间曲线陡峭，再次验证发酵温度对SDF得率影响较发酵时间大，同时由等高线图可知，其中A（发酵时间）、B（发酵温度）两因素等高线图呈现椭圆形，因此交互作用最为显著，这与方差分析表中的结果相符合。经过响应面条件优化，得到结果为发酵时间22.43 h，发酵温度35.28℃，接种量6.55%，此条件下SDF得率为11.66%。

2.7 验证试验

考虑到实际情况，为方便操作，修改发酵条件为发酵时间22.4 h，发酵温度35.0℃，接种量6.6%，在此条件下进行验证试验，取3次试验平均值。得到的SDF平均得率为12.88%。与理论值相差1.22%，模型有效，试验数据与实际情况相符合。

3 结论

近年来，膳食纤维的研究一直是国内外研究热点，新的研究方法和技术被应用于可溶性膳食纤维的研究中，膳食纤维更多的生理活性和加工特性也正在被发掘[14]。米糠粕是一种极好的质优价廉的膳食纤维资源，利用B.subtilis B4发酵米糠粕，采用单因素试验和响应面分析法优化SDF得率[15]，确定最佳工艺参数为：发酵时间22.4 h，发酵温度35.0℃，接种量6.6%。在此优化条件下，SDF得率为12.88%，较优化前提高了8.88%。

本试验中采用B.subtilis B4发酵米糠粕，使可溶性膳食纤维得率显著提高，表明微生物发酵法是一种高效可行的改性膳食纤维的方法，为获得高品质膳食纤维提供了理论依据，因此具有十分广阔的应用前景[16]。

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Extraction of soluble dietary fiber in ricebranmealbym icrobial fermentationmethod

M IN Zhongman,JIA Xiaoyu,XIETiem in,ZHOU Yumeng,GONGM ingjuan,XU Xue,XIAO Zhigang*
(College ofGrain Science and Technology,Shenyang NormalUniversity,Shenyang 110034,China)

Using rice branmealasmaterial,Bacillussubtilis B4 as fermentation strains,the effectsofm icrobial fermentationmethodsunder different conditions on soluble dietary fiber(SDF)yield of rice branmealwere discussed.Using time,temperature,inoculum and pH as evaluation factors, single factorexperimentswere carried out.On thebasisof single factorexperiments,the fermentation extraction conditionswereoptimized by central composite design experiments of three factors and three levels.The results shown that the optimum extraction conditions of SDF by fermentation method were fermentation time22.4 h,temperature35.0℃and inoculum 6.6%.Under the conditions,the SDF yield was12.88%,which was8.88% higher than thatofbeforeoptim ization.M icrobial fermentationmethodwasagoodmethod for SDFextraction.

ricebranmeal;soluble dietary fiber;fermentation;response surface analysis

TS201.3

0254-5071（2017）08-0053-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.012

2017-05-31

沈阳师范大学大学生创新创业训练项目（201610166300189）；辽宁省农业青年科技创新人才项目（2015053）；国家星火计划重点项目（2015GA650007）；沈阳师范大学优秀人才支持计划

闵钟熳（1982-），女，讲师，博士，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：肖志刚（1972-），男，教授，博士，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。