HPLC-ELSD法测定五加芪粉中黄芪甲苷的含量

张聪，杨强，樊丽博，张继颖，张晓会

(1.国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，洛阳 471000；2.贵州省兽药饲料监察所，贵阳 550004)

HPLC-ELSD法测定五加芪粉中黄芪甲苷的含量

张聪1，杨强2，樊丽博1，张继颖1，张晓会1

(1.国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，洛阳 471000；2.贵州省兽药饲料监察所，贵阳 550004)

为了建立五加芪粉中黄芪甲苷的含量测定方法，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法，色谱柱为Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水35∶65，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃；采用ELSD检测器，漂移管温度为60 ℃，喷雾器温度为36 ℃，氮气压力为25 psi。结果显示黄芪甲苷在1.524～10.16 μg(r=0.9991)之间的对数值与峰面积的对数值呈良好线性关系，平均加样回收率为99.4%，RSD=4.6%(n=6)。本方法重复性良好，能准确测定五加芪粉中黄芪甲苷的含量，对其质量进行控制。

五加芪粉；黄芪甲苷；HPLC-ELSD法

五加芪粉具有补中益气、扶正祛邪的功效，用于提高禽的机体免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。五加芪粉处方由黄芪和刺五加两味药材组成，其中黄芪为君药。黄芪主要化学成分为多糖类[1]、皂苷类[2]及黄酮类[3]等，现代药理学研究表明黄芪具有显著的免疫增强作用[4-5]，可提高畜禽免疫力，广泛用于现代化畜禽养殖。黄芪甲苷做为黄芪提升免疫的主要活性成分[6]，是控制黄芪及其制剂质量的重要指标，因此将其做为控制五加芪粉质量的指标。本文研究建立了高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)测定五加芪粉中黄芪甲苷的含量，为其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱系统(Waters e2695型HPLC；2424型ELSD；Empower 2色谱工作站软件)；Kromasil 100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典AKZO NOBLE公司；AB265-S电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；HS3120型超声波清洗器；甲醇、正丁醇、氨水为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品，含量：100%，批号：110781-200613，中国食品药品检定研究院；五加芪粉，规格：1 g相当于3.3 g生药，批号：20120201、20120202、20120203，由洛阳惠中兽药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(35∶65)；流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃；ELSD检测器：漂移管温度为60 ℃，喷雾器温度为36 ℃，氮气压力为25 psi。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2.2 溶液配制

2.2.1 黄芪甲苷对照品溶液制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取供试品2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50 mL甲醇超声提取30 min，抽滤，滤渣连同滤纸放回锥形瓶中，再加50 mL甲醇超声提取30 min，抽滤，用30 mL甲醇洗涤滤渣和滤纸，合并滤液，减压回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次约40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度、摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 取制备的缺黄芪阴性样品适量(相当于刺五加1.2 g)，置具塞锥形瓶中，照2.2.2项下操作制备成阴性对照溶液。

2.3 测定法 分别精密吸取对照品溶液5、15 μL，供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 照上述2.1项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液15 μL、供试品溶液10 μL、阴性对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，阴性对照溶液在黄芪甲苷对照品相应的保留时间处无干扰，见图1。

2.4.2 线性 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成浓度为0.5080 mg/mL的对照品溶液，依次精密吸取3、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，以黄芪甲苷峰面积的对数值(y)为纵坐标、黄芪甲苷进样量(x)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为y=1.4828x+5.312(r=0.9991)。结果表明，在1.524～10.16 μg范围内，黄芪甲苷峰面积对数值与进样量对数值线性关系良好，结果见图2。

2.4.3 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测得黄芪甲苷峰面积RSD为0.8%，结果表明，本方法精密度良好。

2.4.4 重复性试验 精密称取同一批号的供试品(批号：20120201)2 g，按上述2.2.2项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，测得黄芪甲苷的平均含量为2.7 mg·g-1，RSD为1.6%，表明本方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，测得黄芪甲苷含量的RSD为2.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品(批号：20120201)1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.5380 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液5 mL，平行操作6份，按2.2.2项下方法制备加样回收供试品溶液，测定并计算加样回收率，测得平均回收率为99.4%，RSD为4.6%，表明方法准确度良好，结果见表1。

1.黄芪甲苷对照品 2.供试品 3.阴性对照1. Reference Substance of Astragaloside 2. Test sample 3. negative control图1 专属性考察色谱图Fig 1 The chromatogram of Specific inspection

图2 黄芪甲苷标准曲线Fig 2 The standard curve of Astragaloside

编号No.样品称量/gAmountofsample对照加入量/mgAmountofreferencesubstance测得总量/mgAmountofmesured回收率/%Recovery平均值/%meanRSD/%11.01042.695.2695.7320.97092.695.1495.2530.96722.695.1395.1541.04962.695.60104.4551.02642.695.47101.7861.01982.695.51104.1799.44.6

2.4.7 样品测定 取3批供试品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液并测定，计算黄芪甲苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果Tab 2 The results of sample content determination

3 讨 论

3.1 黄芪甲苷含量测定方法的选择 文献报道的黄芪甲苷含量测定方法有荧光分光光度法[7]、薄层色谱扫描法[8]、高效液相色谱法[9]等，其中高效液相色谱法准确、快速、灵敏度高，且使用蒸发光散射检测器可解决黄芪甲苷紫外吸收弱的缺点，是黄芪甲苷含量测定的常用方法。

3.2 提取溶剂和提取方法的选择 五加芪粉为黄芪和刺五加经水提、纯化、喷雾干燥制成的粉剂，含有较多的多糖类成分，为了充分提取其中的黄芪甲苷，参考同类制剂的供试品溶液制备方法[10-11]，选择甲醇作为提取溶剂，分别对热回流法和超声提取法进行对比，结果表明两种方法提取效果相当，考虑超声提取较为简便，因此选择超声提取法。试验过程中发现，超声提取1次不能将黄芪甲苷提取完全，提取2次和提取3次结果差别不大，因此选择超声提取2次，并且最后用甲醇洗涤残渣，以保证黄芪甲苷充分转移。

3.3 萃取次数的选择 参考黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定方法[9]，对正丁醇萃取次数进行了考察，分别进行3次、4次、5次萃取，结果发现萃取4次之后，黄芪甲苷基本完全转移，因此确定采用正丁醇萃取4次。试验发现，正丁醇萃取液蒸干后再通过D101型大孔吸附树脂柱纯化，黄芪甲苷的回收率相对较低，而且未经大孔吸附树脂柱纯化的样品在含量测定过程中不受其他杂质的影响，因此，确定正丁醇后不再通过大孔吸附树脂柱纯化，直接用甲醇溶解测定。

3.4 色谱条件的考察 参考黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定色谱条件[9]，分别对流动相的比例、柱温、流速、柱子型号进行考察，结果表明黄芪甲苷的色谱行为受流动相比例影响较大，其他条件对其影响相对较小，综合系统适用性各指标，确定流动相的比例为乙腈-水(35∶65)，此时黄芪甲苷保留时间约7 min，更加适合该产品的检测。此外，对蒸发光散射检测器漂移管温度进行了考察，60 ℃、70 ℃、80 ℃条件下黄芪甲苷峰各项指标差别不大，因此设定漂移管温度为60 ℃。

本研究建立了高效液相色谱-蒸发光散射法测定五加芪粉中黄芪甲苷的含量，在该色谱条件下，黄芪甲苷分离度良好，保留时间适宜，方法学考察表明该方法专属性、精密度、重复性良好，可准确测定黄芪甲苷的含量，从而有效控制五加芪粉的质量。

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(编辑：陈希)

Determination of Astragaloside in Wujiaqi Powder by HPLC-ELSD

ZHANG Cong1, YANG Qiang2, FAN Li-bo1, ZHANG Ji-ying1, ZHANG Xiao-hui1

(1. National Research Center for Veterinary Medicine/Luoyang Huizhong Veterinary Medicine Co., Ltd, Luoyang 471000, China;2. Guizhou Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff, Guiyang 550004, China)

To establish the method for determining of astragaloside in Wujiaqi powder by HPLC-ELSD, C18 column (Kromasil 100-5C18, 150 mm×4.6 mm, 5μm)was used with the mobile phase consisted of acetonitrile-water (35∶65), the flow rate was 1.0 mL/min, column temperature was 30 ℃, Evaporative light scattering detection condition: drift tube temperature was 60 ℃, spray tube temperature was 36 ℃, the nitrogen pressure was 25 psi. The calibration curve was linear at a range of 1.524～10.16 μg for astragaloside (r=0.9991), the average recovery was 99.4% andRSDwas 4.6%(n=6). The method was accurate with a good reproducibility and can be used as a quantitative analysis of astragloside in Wujiaqi powder.

Wujiaqi powder; astragaloside; HPLC-ELSD

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.11

张聪，硕士，从事新兽药质量标准研究工作。E-mail: zhangcong301@163.com

2017-03-29

A

1002-1280 (2017) 08-0062-05

S853.7