一例典型猪瘟病例的综合诊断
2017-09-03王玉超李保全胡东方古金元陈同煜刘思当肖一红
王玉超,李保全* ,胡东方,古金元,陈同煜,彭 涛,刘思当,肖一红
(山东农业大学,山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,山东 泰安 271000)
一例典型猪瘟病例的综合诊断
王玉超,李保全* ,胡东方,古金元,陈同煜,彭 涛,刘思当,肖一红
(山东农业大学,山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,山东 泰安 271000)
2016年12月山东泰安某养殖户的70头育肥猪,部分猪出现了高烧不退、弓背喜卧、眼角分泌物增多、粪便干结、全身皮肤点状出血等疑似猪瘟症状;病理剖检可见全身皮肤、浆膜、肾、胃肠黏膜、肺等器官组织广泛性渗出性出血;采集病猪病料,提取RNA,用猪瘟病毒基因特异性引物进行RT-PCR,琼脂糖凝胶电泳结果显示,病料呈猪瘟病毒核酸阳性,确诊该病例为猪瘟病毒的急性感染。
猪瘟;剖检;组织病理学;RT-PCR检测
猪瘟又称经典猪瘟或古典猪瘟(Classical swine fever,CSF或hog cholera),是猪的一种高度传染性疾病。在我国俗称烂肠瘟。为世界动物卫生组织所列的A类16种法定传染病之一。猪是自然条件下对猪瘟病毒唯一易感的动物,传播途径主要通过直接接触,或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔黏膜和破损的皮肤均为感染途径。一年四季都可发生,以春夏多雨季节多发。是目前威胁我国养猪业的主要传染病之一。自然感染的潜伏期常为3~6 d,也有延长至24 d的。根据病程长短、临床症状和特征的不同,常将本病分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型等4种类型。最急性型较少见,病猪体温升高,常无其他症状,1~2 d内死亡。急性型最常见,体温可上升到41 ℃以上,食欲减退或消失,可发生眼结膜炎并有脓性分泌物,鼻腔也常流出脓性黏液,间有呕吐,有时排泄物中带血液,甚至便血。初期耳根、腹部、股内侧的皮肤常有许多点状出血或较大红点。病程一般为1~2周,最后绝大多数死亡。亚急性型常见于本病流行地区,病程可延至2~3周;有的转为慢性,常拖延1~2个月。表现黏膜苍白,眼睑有出血点。皮肤出现紫斑,病猪极度消瘦。死亡以仔猪为多,成年猪有的可以耐过。非典型病猪临诊症状不明显,呈慢性,常见于“架子猪”。2016年12月,我国山东泰安某养殖户所饲养的70头育肥猪中先后出现了高烧不退、弓背喜卧、被毛粗乱、粪便干结、眼角分泌物增多,随后腹部及四肢内侧出现出血斑点等疑似猪瘟症状,猪群没有免疫猪瘟疫苗,经病理剖检和RTPCR诊断确诊为猪瘟病毒急性感染。
1 材料与方法
1.1 实验材料
病例来自山东泰安某农户饲养的育肥猪群发病猪,病猪剖检,采集淋巴结和肾脏等病变组织。病料处理:取病死猪扁桃体、淋巴结、脾脏等组织,剪碎,添加3倍灭菌生理盐水,用匀浆机研磨制成悬液;反复冻融3次;9 000 r/ min离心3 min取上清液;分子生物学试剂:RNA提取试剂盒采用北京全式金Easy Pure Viral RNA/DNA Kit(批号:K10314)。PCR相关试剂为北京全式金相关产品。根据Genbank公布的序列设计猪瘟病毒的特异性引物,扩增目标片段大小约为600bp,其序列分别为:
F-TRACCAYGCAYATGWCAGAAGTACC
R-AGTCGACTTCCCTGGTTTCACTTG
1.2 实验方法
1.2.1 临床诊断与剖检
观察和记录病猪临床症状,剖检死亡猪只,检查大体病变,并采集具有典型病变的器官组织,-80 ℃冷冻备用。
1.2.2 总RNA 提取
按照全式金Easy Pure Viral RNA/ DNA Kit 说明书进行操作:加入20 μL Proteinase K于一个无菌的1.5 mL离心管中。在高心管中加入200 μL样品。加入200 μLBB5 (包含5.6 μg CarrierRNA) ,涡旋混合15秒。56 ℃孵育15 min。加入250 μL无水乙醇(此时可能会出现絮状沉淀) ,涡旋混合15 s,室温放置5 min。将溶液和沉淀一起加入离心柱中,12 000 r/min离心1 min,弃掉流出液。加入500 μL WB5, 12 000 r/ min离心1 min,弃掉流出液。再加入500 μL WB5, 12 000 r/min离心1 min,弃掉流出液。室温12 000 r/ min离心1 min,彻底去除残留的乙醇,在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱转入一个新1.5 mL RNase-free离心管中, 并向离心柱中加20~50 μLRNase-free Water, 室温静置1 min。室温12 000 r/min离心1 min,洗脱RNA。将RNA置于-80 ℃保存。
1.2.3 RT-PCR 反应及电泳
RT-PCR反应采取20 uL体系,反应条件为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30循环;72 ℃ 7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。
2 结果与分析
2.1 临床症状
送检病猪临床主要表现为极度的精神沉郁,食欲废绝,被毛粗乱,扎堆,发烧,体温在40~41℃,腹部及四肢内侧皮肤可见出血点及出血斑。
2.2 剖检病变
对死亡的猪只进行剖检,肾脏表面密布针尖大出血点(图1-A);切面皮质部也见有点状出血(图1-B);全身淋巴结肿大出血(图1-C);胃黏膜散在纽扣状溃疡灶(图1-D);病猪脾脏边缘有明显的出血性梗死灶(图1-E);大脑膜血管充血、出血(图1-F)。
图1 病猪剖检病变
图2 病猪的组织病理学变化
图3 1%的琼脂糖凝胶电泳
2.3 病理组织学检查
将采集的组织器官病料经常规石蜡切片、HE染色后镜检,可见典型的病毒性脑炎病变,大脑血管周围有大量的淋巴细胞和单核细胞浸润形成“脑血管袖套现象”(图2-A);肾小球体积增大,充血、出血(图2-B),肾小管上皮细胞变性、坏死,肾间质及肾髓质区充血、出血(图2-C);脾脏出血性梗死区充满红细胞(图2-D);淋巴结淋巴细胞崩解坏死,胞核浓缩深染、崩解破碎、溶解消失(图2-E)。
2.4 RT-PCR 结果
提取病变淋巴结和肾脏组织总RNA,用参照已发表的猪瘟病毒序列设计合成的猪瘟特异性引物,进行猪瘟病毒核酸RT-PCR检测,结果扩增了约600 bp的条带,显示病料呈猪瘟核酸阳性。
3 防治措施
1)隔离病猪。对保育舍发病猪只立即进行隔离,对发病严重、无治疗价值的病猪立即扑杀,减少病猪的排毒;禁止病猪舍饲养人员随意串舍,进出猪舍必须严格消毒。
2)严格消毒。发病猪舍立即进行带猪消毒,使用碘制剂等对猪刺激小但是效果好的消毒剂喷雾消毒,同时对猪圈及饲喂器具进行彻底消毒。
3)紧急免疫。对保育舍健康猪及假定健康猪使用猪瘟弱毒疫苗实行紧急免疫,剂量为正常免疫的2~4倍,并且保证一猪一针头,防止交叉感染,对发病猪单独进行紧急免疫,剂量为正常免疫的8~10倍,随时观察猪群情况,出现病情加重的猪只立即扑杀,无害化处理,防止散毒。
4)加强饲养管理。立即停止猪场猪只的买卖,减少猪群应激反应,保持猪圈干燥,及时清理粪污,加强通风换气,降低饲养密度。
5)调整免疫程序。对猪场种猪群(公猪、后备母猪及经产母猪)立即进行1次猪瘟疫苗普免;仔猪首免日龄改为25日龄,并且55~60日龄进行第2次免疫。
2017-02-16)
本研究由国家重点研发计划项目“猪重要疫病免疫防控新技术研究”子课题“规模化猪场科学合理的免疫程序的研究(2017YFD0500605)”支持;山东省“双一流”奖补资助。
李保全