基于肺与大肠相表里的“肠病及肺”动物模型制备

张淑坤，张艳敏，崔乃强

实验研究

基于肺与大肠相表里的“肠病及肺”动物模型制备

张淑坤，张艳敏，崔乃强

目的：制备适用于研究“肺与大肠相表里”理论的“肠病及肺”大鼠模型。方法：20只SPF级雄性Wistar大鼠，随机分为模型组和假手术组，模型组采用腹腔注射人工胃液后2 h再注射大肠杆菌的方法制备的“肠病及肺”大鼠模型，造模后6 h测定大鼠肛温，取全段结肠中的粪便用于结肠粪便含水量测定，取末端回肠和肺组织用于髓过氧化物酶(MPO)活性和病理学检测。结果：与假手术组相比，模型组大鼠体温升高，结肠粪便含水量减少,回肠和肺组织MPO活性增加（1.39±0.21 vs 0.72±0.16和1.51±0.26 vs 0.86±0.20，P＜0.05）；同时模型组大鼠显微镜下可见回肠绒毛排列紊乱、萎缩或脱落，肺间质水肿、出血，部分肺泡塌陷、融合；透射电镜下可见肠上皮细胞间紧密连接破坏，线粒体嵴断裂，肺泡Ⅱ型上皮细胞胞浆浓缩，细胞核固缩，伴空泡化。结论：采用腹腔注射人工胃液后注射大肠杆菌的方法制备的“肠病及肺”大鼠模型，原发病在腹腔，同时具备肠和肺损伤，是研究“肺与大肠相表里”脏腑相关理论的一种合适的实验动物模型。

肺与大肠相表里；肠病及肺；动物模型

肺和大肠气机升降出入与气化功能，维持肺的宣发和肃降，实现对呼吸运动、津液敷布、水液代谢和大肠传导功能的有序调节。“肺与大肠相表里”语出《内经》，《灵枢·本输篇》言：“肺合大肠，大肠者，传导之府”[1]。肺为脏，属阴；大肠属腑，为阳。肺与大肠通过手太阴经与手阳明经的相互络属，在生理功能上的密切配合，构成一组脏腑阴阳表理关系。为进一步研究“肺与大肠相表里”理论及疾病“由肠及肺”的机理，我们设计并制备了基于腹腔感染的阳明腑实证大鼠模型。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心。动物许可证号为SCXK(军)2009-003，体质量（280±20）g。在动物实验中心适应性饲养1周。

1.2 主要试剂及配制 髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒为南京建成生物公司产品。大肠杆菌菌株来自临床腹膜炎病人，经全自动微生物分析系统（VITEK-AMS)鉴定为大肠杆菌(生物号3001721278)。将大肠杆菌接种在营养琼脂培养基上，37℃培养18 h，生理盐水冲洗菌苔，比浊法测定大肠杆菌浓度，配置浓度为2×109cfu/mL的细菌悬浊液。取10.5%盐酸16.4 mL，胃蛋白酶（sigma公司）10 g，加生理盐水至1000 mL，配制成pH=1.5的人工胃液。

1.3 动物模型制备 20只SPF级雄性Wistar大鼠，随机分为模型组和假手术组。实验前自由进食水。制备大鼠重症腹腔感染模型无菌条件下，取1 mL人工胃液于大鼠右下腹腔内注入，2 h后按3∶1的比例右下腹腔内注入2×109cfu/mL大肠杆菌加10% BaSO4营养肉汤0.9 mL，并在注射处按摩20 s，促进吸收[2]。假手术组以等量蒸馏水取代人工胃液注入，2 h后同样按3∶1的比例右下腹腔内注入生理盐水加10%BaSO4营养肉汤0.9 mL。造模后6 h，所有大鼠麻醉，测定肛温，开腹开胸,取末端回肠和肺组织用于MPO活性和病理学检测，取全段结肠中的粪便用于结肠粪便含水量测定。

1.4 结肠粪便重量和含水量测定 取全段结肠中的粪便,称湿重后置于80℃烤箱中48 h，称干燥后粪便重量(干重)。粪便含水量=（湿重-干重）/湿重× 100%。

1.5 回肠和肺组织HE染色 回肠和左肺下叶用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，3 μm厚度连续切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察肠黏膜和肺组织组织病理改变。

1.6 回肠和肺组织电镜观察 将回肠和肺组织切成1 mm厚左右小块,置于2%预冷的戊二醛溶液固定24 h，磷酸缓冲液冲洗后2%锇酸后固定，梯度乙醇脱水,醋酸铀块染，苯二甲酸二丙烯脂渗透包埋,常规超薄切片，枸椽酸铅染色，上镜观察并照相。

1.7 回肠和肺组织MPO活性 按试剂盒说明化学比色法测定，结果以U/g蛋白表示。

2 结果

2.1 一般情况 模型组大鼠竖毛、蜷缩、少动，无挣扎反抗，假手术组大鼠精神良好，活动自如，挣扎有力。与假手术组比较，模型组大鼠进食量减少，体温升高幅度（△T=造模6 h体温-造模时体温）升高有统计学意义（P＜0.05，见表1）

2.2 结肠粪便重量和含水量变化 与假手术组比较，模型组大鼠结肠粪便含水量减少（P＜0.05，见表1）。

表1 两组大鼠体温、进食量和结肠粪便含水量变化(±s)

注：与假手术组比较，aP＜0.05

组别假手术组模型组n 10 10△T（℃）0.44±0.09 1.14±0.13a进食量（g）8.20±0.10 5.61±0.57a粪便含水量（%）63.28±6.18 45.06±5.22a

2.3 回肠组织病理学观察 显微镜下可见模型组大鼠回肠绒毛排列紊乱、萎缩变短、部分上皮细胞脱落，固有层可见集合淋巴小结数量增多，固有层、伴黏膜下层、肌层和浆膜均可见少量炎细胞浸润。假手术组回肠黏膜上皮排列有序，绒毛结构清晰，组织结构大致正常(见图1)。

2.4 肺组织病理学观察 模型组大鼠肺间质水肿、出血，肺泡壁断裂，肺泡有塌陷、融合，肺泡腔内可见炎细胞浸润；假手术组大鼠肺血管、肺泡间质和肺泡腔均未见明显异常(见图2)。

图2 各组大鼠肺组织病理变化（HE染色，×200）

2.5 回肠组织超微病理改变 模型组肠上皮细胞间紧密连接破坏，细胞间隙增宽；线粒体重度肿胀，嵴断裂，内质网显著扩张。细胞核固缩，核膜不整齐，可见凋亡细胞。假手术组肠上皮细胞间紧密连接排列整齐。线粒体丰富，无肿胀；细胞核呈椭圆形，核膜完整(见图3)。

图3 两组大鼠肠上皮细胞紧密连接及细胞形态改变

2.6 肺组织超微病理改变 模型组肺组织透射电镜观察，可见肺泡Ⅱ型上皮细胞出现不同程度形态学改变,包括细胞体积缩小变圆，细胞核呈不规则形，核被膜外折或内陷，核固缩并边集在核膜下呈月牙状或腰带状，胞浆浓缩，胞浆内嗜锇性板层体减少，排空增多，伴空泡化。假手术组大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞形态正常（图4）。

2.7 回肠和肺组织MPO活性 与假手术组比较，模型组大鼠回肠和肺组织MPO活性升高（P＜0.05，见表2）。

3 讨论

阳明腑实证出自《伤寒论》，是指外邪人里化热，与大肠的燥热相合，以致津液被耗，燥结成实，阻滞于中，即产生潮热、谵语、便秘、腹满而痛、脉沉实等证。《伤寒论》说：“阳明之为病，胃家实是也”。我们大量临床研究发现，在重症急腹症和严重腹内感染时患者存在明显的痞满燥实的阳明腑实证候，如疾病不能得到很好的治疗，将发生急性肺损伤甚至ARDS[3]。严重阳明腑实证能影响肺的肃降，若大肠热结，上灼于肺，导致肺气不降，可出现呼吸急迫，咳嗽气喘。是为“肺与大肠相表里”理论中“肠病及肺”的病理过程[4-5]。

图4 两组大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞超微病理改变

表2 两组大鼠回肠和肺组织MPO活性变化（U/g，±s）

表2 两组大鼠回肠和肺组织MPO活性变化（U/g，±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05

组别假手术组模型组n 肺10 10 MPO活性回肠0.72±0.16 1.39±0.21a0.86±0.20 1.51±0.26a

一些学者对阳明腑实证和“肺与大肠相表里”理论有所研究，但均缺乏“证”和能导致肺肠脏腑相关的模型。在制备中医“证”的动物模型中，应保证符合“证”的症候，并注意导致“证”产生的病因[2,6-7]。“肠病及肺”动物模型应满足原发病在肠（腹腔），并同时具备肠和肺组织损伤两个基本条件[8-9]。以三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇相结合的方法诱导实验性大鼠溃疡性结肠炎模型，观察到肠病大鼠呼吸道和肠道的部分菌群出现同步增多或减少的相关性变化,提示微生态菌群的变化可能是"肠病及肺"的发病机制之一[10]。我们采用模拟溃疡病穿孔病理过程和临床特征的方法制作“肠病及肺”大鼠模型，对传统腹腔注射大肠杆菌方法进行改进，先经腹腔注射人工胃液，造成化学性腹膜炎，之后再注射来自化脓性阑尾炎分离、鉴定的大肠杆菌，形成细菌性腹膜炎。依此法制备的疾病模型，较盲肠结扎穿刺法形成的腹膜炎模型重复性强、稳定性好，病理证实同时具有肠黏膜屏障破坏和肺组织损伤，电镜观察进一步明确，肠黏膜屏障破坏以回肠上皮细胞坏死为主要特征，肺组织损伤以Ⅱ型肺泡上皮细胞坏死为主。

MPO是中性粒细胞的标志酶，可用于评估中性粒细胞浸润程度。“肠病及肺”大鼠回肠和肺MPO活性升高，说明组织中性粒细胞增多，回肠和肺组织炎症反应增强。我们还同时发现模型组大鼠竖毛、蜷缩少动，腹胀、进食减少，体温升高，结肠粪便含水量减少，说明大鼠有痞满燥实坚等表现，符合阳明腑实证。

本文采用腹腔注射人工胃液后注射大肠杆菌的方法制备的“肠病及肺”大鼠模型，不仅体现了原发病在肠（腹腔），同时还伴有肠和肺的组织病理学损伤和炎性反应增强，为进一步研究“肺与大肠相表里”脏腑相关理论提供了可靠的实验模型。

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[2]陈小兵,杨宇,唐宇娇.“肠病及肺”动物模型的建立研究思路探讨[J].云南中医中药杂志,2012,33(2):7-9.

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（收稿：2017-01-16 修回：2017-03-20）

（责任编辑 田在善 屈振亮）

Preparation of a Model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”in Rats Based on the Theory of“Exterior and Interior Relationship between Lung and Large Intestine”

ZHANG Shu-kun, ZHANG Yan-min,CUI Nai-qiang
Tianjin Institute of Acute Abdominal Diseases of Intergrated Traditional Chi⁃nese and Western Medicine,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To prepare a model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”in rats which suitable for research the theory of“Exterior and Interior Relationship between Lung and Large Intestine”. Methods SPF male Wistar rats(n=20)were randomly divided into sham-operation group and model group. The model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”was prepared by intraperitoneal injection of artificial gastric juice and Escherichia coli.At 6 h after modeling,the rectal temperature and the water content in the whole colon fecal were measured;the MPO activity and the histopathological changes of ileum and lung were examination. Results Compared with sham operation group,the body temperature of rats in model group was increased,the water content of colon fecal was decreased,and the MPO activity of ileum and lung was in⁃creased(1.39±0.21 vs 0.72±0.16 and 1.51±0.26 vs 0.86±0.20，P＜0.05).Microscopically,the ileal villi of the model group were disorganized,atrophic or detached,the alveolar septa became markedly damaged and the fu⁃sion of alveoli appeared.Transmission electron microscopy showed that the tight junctions between intestinal epi⁃thelial cells were disrupted,the mitochondrial cristae were broken.In alveolar type II epithelial cell of the model group,cytosolic concentration,pyknosis,and vacuolization were observed. Conclusion The rat model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”is a suitable model to research the theory of“Exterior and Interior Relationship between Lung and Large Intestine”.

Exterior and interior relationship between lung and large intestine;large intestine disease caus⁃ing pulmonary disease;animal model

Q95-34;R655.3

：A

：1007-6948(2017)04-0373-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.010

国家重点基础研究发展计划（2009CB522700）

天津市南开医院急腹症研究所（天津 300100）

崔乃强，E-mail:nctsui@126.com