ACC脱氨酶菌株的分离筛选及对丹参毛状根的影响

尤 红，普 倩，文 芳，饶君凤，李 欧,b，胡秀芳,b

(1.浙江理工大学，a.生命科学学院；b.浙江省植物次生代谢与调控重点实验室，杭州 310018；2.杭州职业技术学院临江学院，杭州 310018)

ACC脱氨酶菌株的分离筛选及对丹参毛状根的影响

尤 红1a，普 倩1a，文 芳1a，饶君凤2，李 欧1a,b，胡秀芳1a,b

(1.浙江理工大学，a.生命科学学院；b.浙江省植物次生代谢与调控重点实验室，杭州 310018；2.杭州职业技术学院临江学院，杭州 310018)

为研究1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Aminocylopropane-1-carboxylic acid，ACC)脱氨酶菌株对丹参次生代谢物合成的影响，使用筛选获得的ACC脱氨酶活性最强的丹参根际菌株对丹参毛状根进行诱导，并分析诱导前后毛状根生物量以及药用活性物质含量的差异。结果表明：获得了ACC脱氨酶活性最高的菌株为DS3T3，其酶活力达到0.3899 U/mg，经鉴定该菌株为假单胞菌属细菌(Pseudomonassp.)；丹参毛状根经该菌株诱导处理后，其干重与对照组相比增加16.22%，主要酚酸物质总量增加16.07%；对DS3T3进行进一步的测定结果表明，该菌株还具有固氮、产铁载体及产吲哚-3-乙酸和水杨酸等植物激素的能力。因此，该菌株可作为提高丹参产量以及品质的候选菌株。

ACC脱氨酶；生物固氮；铁载体；植物激素；促生作用；丹参毛状根；丹酚酸；假单胞菌

0 引 言

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)是唇形科鼠尾草属多年生草本植物，它作为重要的药用植物，广泛用于心脑血管疾病的治疗[1]。丹参药用有效成分主要分水溶性的丹酚酸类物质(丹参素、丹酚酸B和迷迭香酸等)和脂溶性的丹参酮类物质(丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮和隐丹参酮等)，均有着非常明确的药理活性[2]。目前，医药化工等行业对丹参需求量增加，然而丹参的野生资源锐减，种植丹参量虽多，但其生长周期长，药用有效成分含量低，产地存在环境污染，这些因素严重影响种植丹参的品质和产量[3]。因此，需要使用现代生物学技术来提高丹参的品质和产量。

近几年，丹参毛状根是研究丹参药效成分代谢调控用于提高丹参品质的重要体系[4]。诱导是增加毛状根的生物量及次生代谢物含量常见的有效策略[5]。丹参作为药用植物，其次生代谢物的合成通常在受到环境胁迫的情况下发生，特别是在植物防御病原微生物入侵时。因此，微生物通常作为诱导子用于促进植物次生代谢。植物根际促生微生物为常见的微生物诱导子之一，它依附于植物根表，直接或间接地影响植物的生长和发育[4]。1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocylopropane-1-carboxylic acid，ACC)脱氨酶是许多植物根际促生细菌共有的特征性酶[6]。Xu等[7]发现含有ACC脱氨酶活性的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)能够显著提高番茄幼苗生长。Shaharoona等[8]发现含有ACC脱氨酶活性的假单胞菌(Pseudomonas)属菌株在氮源丰富情况下能够促进玉米生长和产量。Holguin等[9]将含有ACC脱氨酶基因acdS的质粒转化巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)，结果提升该菌株的促生作用。因此，通过检测ACC脱氨酶来筛选植物促生长菌的方法被广泛使用[10]。

目前，国内外关于具ACC脱氨酶活性菌株对丹参生物量以及丹酚酸含量积累影响的研究尚未见报道。本文以ACC为唯一氮源筛选丹参根际ACC脱氨酶菌株并测定ACC脱氨酶活性，以获得的酶活性最强菌株为材料，测定该菌对丹参毛状根生长和次生代谢的影响，并进一步测定该菌株的固氮、产铁载体和产植物激素能力。

1 材料与方法

1.1 材料

a) 丹参样品：野生丹参样品采集于丹参主要产地陕西省商洛市。

b) 培养基：富集培养基PAF、筛选培养基DF和加富培养基ADF培养基配制参考文献[11]。

1.2 ACC脱氨酶菌株的分离筛选及酶活力测定

1.2.1 ACC脱氨酶菌株的分离和初步筛选

将野生丹参根部紧密结合的土壤刷下作为根际土壤样品，将同地区3个根际土壤样品等量混合后，加入100 mL无菌水，振荡，获得土壤悬浮液。将土壤悬浮液接入50 mL PAF培养基中，28 ℃，220 r/min振荡培养2 d；取1 mL PAF培养液，接种于50 mL DF培养基中培养1 d后，取1 mL DF培养液接种于ADF培养基中培养1 d。稀释ADF培养液，并将其涂布于ADF固体平板上，28 ℃培养至出现单菌落并纯化，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 ACC脱氨酶活力测定

将保藏菌株活化后，参照Bradford法测定细菌细胞提取液中总蛋白质含量[12]。以牛血清白蛋白为标准物，制作标准曲线。参照Saleh等[13]的方法测定ACC脱氨酶活力，比活力的计算公式为：

测定结果为重复三次的平均值。

1.3 ACC脱氨酶菌株对丹参毛状根生物量以及次 生代谢的影响

1.3.1 毛状根制样

毛状根由本实验室保存。无菌条件下，在50 mL的6,7-V培养基中加入0.2 g生长旺盛的丹参毛状根，25 ℃，110 r/min避光振荡培养18 d。

1.3.2 ACC脱氨酶菌株诱导子的制备及诱导

将保存在-80 ℃冰箱的菌株活化后，接入50 mL营养肉汤培养基中；28 ℃，220 r/min振荡培养3 d；4 ℃，12000 r/min，离心10 min，收集上清液。使用0.22 μm无菌过滤器过滤除菌，滤液作为后续实验的诱导子，放入4 ℃冰箱备用。

在培养18 d后的毛状根中加入制备好的诱导子1.5 mL，对照组中加入相同体积的培养基，设3个重复，相同条件下继续培养6 d。

1.3.3 丹参毛状根生物量以及次生代谢物含量的测定

收集诱导后的毛状根，吸水纸吸干，45 ℃干燥至恒重，称量。用研钵磨碎烘干的毛状根，过0.45 mm筛网，称取0.05 g，加入5 mL 70%的甲醇提取液，超声45 min(间或颠倒混合)，8000 r/min离心10 min，取上清过0.45 μm滤膜备用。

丹酚酸类成分含量的测定采用高效液相法，所测定的物质为丹参素、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和肉桂酸。所使用的高效液相色谱仪为Waters 1525，检测器为Waters 2996，色谱柱为ZORBAX Extend-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。色谱条件为：流速1 mL/min，柱温30 ℃，上样体积20 μL，检测波长为288 nm；以乙腈和0.026%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，梯度设定参照张顺仓等的方法[14]。

1.4 固氮、产铁载体和产植物激素能力测试

1.4.1 固氮能力测定

在无氮培养基中接入待测菌株，28 ℃，220 r/min，振荡培养一周，再转接到新的培养基中，重复5次，观察菌株的生长状况。

1.4.2 产铁载体能力测定

在CAS产铁载体能力检测平板上接入待测菌株，28 ℃，220 r/min，培养一周，观察培养基上有无橙色晕圈出现。

1.4.3 产植物激素能力测定

菌株接入50 mL的营养肉汤培养基中培养3 d后，稀释至OD600为1.0；4 ℃，12000 r/min，离心5 min，取上清过0.22 μm膜，供液相色谱串联质谱分析。液相色谱串联质谱测定植物生长素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、细胞分裂素和赤霉素在内的43种植物激素，具体种类和测定方法参照Cao等方法[15]。测定结果为三次生物重复值。

1.5 形态特征测定和16S rRNA基因序列测定及 系统发育分析

1.5.1 形态观察以及生理生化测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法[16]，对具有ACC脱氨酶的菌株进行形态以及生理生化测定。

1.5.2 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

以十六烷基三甲基溴化铵法提取细菌总DNA为模板，进行16S rRNA基因PCR扩增；所用引物、反应体系，反应条件参见文献[17]。目的基因PCR产物送往苏州金维智生物科技有限公司测序，测序结果采用EzTaxon和美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)数据库进行同源性比对分析，并采用Mega 5.0软件建立系统发育树。

2 结果分析

2.1 ACC脱氨酶活性菌株的筛选以及酶活性检测

从ACC为唯一氮源的ADF培养基上分离到25株丹参根际微生物，ACC脱氨酶活性测定结果表明，酶活力较高的菌株编号分别为DS1G1、DS3G1和DS3T3。这3株菌株的酶活力见表1，其中酶活力最高的为DS3T3(0.3899 U/mg)，最低的为DS3G1(0.1424 U/mg)。

表1 ACC脱氨酶菌株的酶活力

2.2 菌株对丹参毛状根生物量以及丹酚酸类物质积累的影响

选取酶活力最高的菌株DS3T3用于分析其对丹参毛状根生物量以及丹酚酸类物质积累的影响，结果如表2所示。菌株DS3T3处理后，丹参毛状根的干重比对照组增加16.22%；丹参素、丹酚酸B以及肉桂酸含量增加，增加量分别为8.15%、27.94%和62.77%，而咖啡酸和阿魏酸的含量降低；综合分析该菌株对六种酚酸总含量的影响，结果显示含量增加16.07%。

表2 菌株DS3T3对丹参毛状根生物以及丹酚酸类物质积累的影响

2.3 菌株的固氮、产铁载体和产植物激素能力

为了研究菌株DS3T3对丹参毛状根的促生长以及促丹酚酸物质合成的机理，进一步测定菌株的固氮、产铁载体和植物激素能力。菌株DS3T3固氮能力检测结果如图1所示，菌株DS3T3能够在无氮培养基上生长，说明该菌具有固氮能力。DS3T3产铁载体能力检测结果如图2所示，从图中可见，在CAS检测平板上，菌株DS3T3周围出现橙色晕圈，表明该菌株有产铁载体能力。菌株DS3T3产生的植物激素种类和含量如表3所示。由表3可知，菌株DS3T3发酵液含有多种不同的植物激素，主要为吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)及其衍生物，IAA的含量最高，为559.182 ng/mL，其次为水杨酸、反式-玉米素-α-葡萄糖苷和反式-玉米素-7-葡萄糖苷，含量分别为112.441、35.551 ng/mL和14.830 ng/mL。

图1 DS3T3固氮能力分析

图2 DS3T3产铁载体能力分析

植物激素含量/(ng·mL-1)吲哚-3-乙酸(IAA)559.182±0.782吲哚-3-乙酰基-L-丙氨酸(IAA-Ala)1.269±0.009吲哚-3-乙酰基-L-天冬氨酸(IAA-Asp)10.915±0.021吲哚-3-乙酰基-L-亮氨酸(IAA-Leu)1.051±0.028吲哚-3-乙酰基-L-苯丙氨酸(IAA-Phe)0.133±0.024N6-异戊烯基腺嘌呤(iP)2.201±0.014水杨酸(SA)112.441±0.665反式-玉米素-7-葡萄糖苷(Z7G)14.830±0.008反式-玉米素-α-葡萄糖苷(ZOG)35.551±0.068

注：表中未列出的植物激素为菌株DS3T3中未检测出的。

2.4 形态特征与菌株鉴定

2.4.1 形态及生理生化特征

菌株DS3T3在营养肉汤固体培养基上培养3 d后，形成浅黄色、表面湿润有光泽、圆形凸起且边缘整齐的菌落(图3)。在显微镜下观察到其菌体为杆状，有鞭毛，无芽孢，革兰氏阴性(图4和图5)。DS3T3生理生化特征如表4所示，菌株DS3T3的生理生化特征与假单胞杆菌属(Pseudomonas)相似，它能产生过氧化氢酶和氧化酶，不能产生淀粉酶、酪蛋白酶和纤维素酶，不能利用柠檬酸盐，不产生H2S等。

图3 DS3T3菌落形态

图4 DS3T3菌体形态

图5 DS3T3革兰氏染色结果

生理生化特征结果生理生化特征结果革兰染色-V.P试验+运动能力+M.R试验-产芽孢-纤维素水解-过氧化氢酶反应+柠檬酸盐利用-氧化酶反应+明胶液化-固氮作用+吐温20-产铁载体+吐温80-产H2S-酪蛋白水解-淀粉水解-硝酸盐还原+

2.4.2 16S rRNA基因比对及菌株鉴定

16S rRNA基因比对结果显示菌株DS3T3与杰氏假单胞菌的模式菌株P.jesseniiCIP 105274T序列相似性最高，为99.93%。图6显示菌株DS3T3与其相似度最高的菌株之间的系统进化关系。系统进化树分析表明菌株DS3T3与P.jesseniiCIP 105274T在同一分支上。根据菌株的形态特征、生理生化特征、16 rRNA基因比对结果以及系统发育树等等结果表明：菌株DS3T3属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)。

图6 菌株DS3T3 16S rRNA基因序列系统发育树注：系统发育树采用邻接法进行构建；分支上的数值表示经1000次计算后的Bootstrap值；括号内为GenBank登录号；比例尺表示菌株间的遗传距离。

3 讨 论

植物根际微生物是影响植物生长发育的主要菌株类型之一。目前，许多研究已经发现这类菌株中有许多具有ACC脱氨酶活性的菌株，而ACC脱氨酶是促生长菌株的特征酶，本文从丹参根际中筛选具有ACC脱氨酶活性并且能够促进丹参活性成分合成的菌株作为优良的微生物资源用于提高丹参的产量和品质。

据文献报道，当ACC脱氨酶活性高于20 nmol -α KA/(mg·h)时，可促进植物生长[18]。从丹参根际中分离DS1G1、DS3G1和DS3T3菌种的酶活力均高于这个值，而菌株DS3T3的ACC脱氨酶活性最高，达0.3899 U/mg。通过生理生化以及16S rRNA基因鉴定，得出DS3T3属于假单胞菌属，其酶活力明显高于之前报道的同菌属P.brassicacearumZy-2-1(酶活力为0.088 U/mg)[19]和恶臭假单胞菌(P.putida)UW4(0.056 U/mg)[19]以及荧光假单胞菌(P.fluorescens)STAD384(酶活力为0.143～0.208 U/mg)[20]。通过进一步的实验，发现该菌株还具有固氮、产铁载体和高产植物激素等特征。生物固氮能力可以为植物提供丰富的氮源，产铁载体能力能够帮助植物更好的摄取环境中的铁源[21]，两种能力都能为植物提供生长所需的原料，促进植物生长。另外，有研究表明，微生物源的植物激素有着调控植物生长和发育的能力[22]，而DS3T3所产生的生长素、戊烯腺嘌呤和玉米素等植物激素已被证实有该能力。例如，绿针假单胞菌(P.chlororaphis)和温哥华假单胞菌(P.vancouverensis)分泌的IAA能够分别促进青椒和小麦的生长[23-24]；戊烯腺嘌呤和玉米素分别对覆盆子和越橘有一定的促生长作用[25-26]。在本文中，丹参毛状根经菌株DS3T3诱导后，其干重与对照组相比增加16.22%，说明该菌株的促生长能力显著。因此，该菌株有着多种促生长特征，并且实际效果明显，在植物促生长方面具有一定的应用价值。

菌株DS3T3除具促生长作用外，对丹酚酸类物质合成也有显著的影响，但其影响因丹酚酸种类而异。综合分析，六种丹酚酸的总含量与对照组相比增加16.07%。其中，评估丹参品质的重要指标之一丹酚酸B的含量增加了27.94%，增加量非常显著。而迷迭香酸的含量有小幅降低，可能原因是该物质是丹酚酸B重要的前体物质[27]，其在DS3T3的作用下更高效率的转化为丹酚酸B。目前，许多生物诱导子都能显著促进丹参酮类物质含量的积累，而生物诱导子对丹酚酸类物质含量提高的研究尚未见报道，所以菌株DS3T3在其中的作用机制值得关注。目前研究表明，丹参毛状根在水杨酸作用下，其丹酚酸B和迷迭香酸的含量明显增加[28-29]。而在该菌株的发酵液中测得丰富的植物激素，且水杨酸的含量较高，达到112.441 ng/mL。所以，推测水杨酸可能是其中起作用的主要物质之一，但需要进一步的实验验证。

4 结 论

本文获得的ACC脱氨酶活性最强的丹参根际菌株DS3T3(Pseudomonassp.)，确定DS3T3酶活力达0.3899 U/mg，并且有多种其它促生长特征，包括固氮、产铁载体以及产植物激素的能力；该菌株显著促进丹参毛状根的生物量；DS3T3还能够促进丹参毛状根中丹酚酸类物质的合成。故该菌株可作为提高丹参产量以及品质的候选菌株。

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(责任编辑： 唐志荣)

Isolation and Screening of Bacteria Strain with ACC Deaminase Activity and Its Effect on Hairy Root ofSalviaMiltiorrhiza

YOU Hong1a, PU Qian1a, WEN Fang1a, RAO Junfeng2, LI Ou1, HU Xiufang1

(1a.College of Life Science; 1b.Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2.Linjiang School, Hangzhou Vocational and Technical College, Hangzhou 310018, China)

To study the effect of 1-aminocylopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase from bacteria strain on synthesis of secondary metabolite ofSalviamiltiorrhiza, rhizosphere bacteria strain of the highest activity of ACC deaminase obtained via screening was used to induce hairy roots ofS.miltiorrhiza, and analysis was made on the difference of hairy root biomass and medicinal active substance content before and after induction. The results indicate that the bacteria strain with highest ACC deaminase activity is DS3T3 (of deaminase activity up to 0.3899 U/mg), which turns out to bePseudomonassp. through identification. Through treatment with the bacteria strain (DS3T3), the dry weight of hairy root ofS.miltiorrhizahas increased by 16.22% comparing with the control group, and the total phenolic acids by 16.07%. Further measurement of DS3T3 shows that the bacteria strain also has the abilities of nitrogen fixation, iron production and the production of phytohormones such as indole-3-acetic acid, and salicylic acid. Therefore, the bacteria strain (DS3T3) can be used to improve the yield and quality ofS.miltiorrhiza.

ACC deaminase; biological nitrogen fixation; siderophore; phytohormone; growth-promoting effect;Salviamiltiorrhizahairy root; salvianolic acid;Pseudomonas

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.09.019

2017-03-20 网络出版日期： 2017-08-07

浙江省公益农业项目(2015C32104)；浙江省自然科学基金项目(LY15C010005)；浙江理工大学启动基金项目(14042217-Y)

尤红(1990-)，女，浙江嘉兴人，硕士研究生，主要从事药用植物次生代谢调控方面的研究。

胡秀芳，E-mail：huxiuf@zstu.edu.cn

Q939.96

A

1673- 3851 (2017) 05- 0720- 07