PTPN14对食管癌的抑制作用及其机制研究*

刘华松，徐兰兰，张军，郭家龙，林称意，原野，曾敏，程栋梁

[1.湖北省十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北医药学院 护理学院，湖北 十堰 442000]

PTPN14对食管癌的抑制作用及其机制研究*

刘华松1，徐兰兰2，张军1，郭家龙1，林称意1，原野1，曾敏1，程栋梁1

[1.湖北省十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北医药学院 护理学院，湖北 十堰 442000]

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶14（PTPN14）对食管癌的抑癌作用及其机制。方法通过转染PTPN14质粒过表达食管癌细胞EC9706中PTPN14的表达，实时荧光定量聚合酶链反应及Western blot检测其过表达效果；四甲基偶氮唑盐比色法检测过表达PTPN14对EC9706细胞增殖的影响；流式细胞术检测过表达PTPN14对EC9706细胞周期的影响；Western blot检测过表达PTPN14对YAP蛋白表达的影响。结果转染PTPN14质粒可上调食管癌细胞系EC9706中PTPN14的表达；过表达EC9706细胞中PTPN14可以抑制食管癌细胞的增殖，使细胞周期阻滞在G1期；过表达EC9706中PTPN14可以下调细胞中YAP的表达水平。结论PTPN14可通过下调YAP，阻滞食管癌细胞周期，抑制细胞增殖。

蛋白酪氨酸磷酸酶14；YAP；增殖；食管癌

食管癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，是我国主要的恶性肿瘤之一，在肿瘤死因中食管癌的死亡率占11.19%，位居第4位，严重影响患者的健康和生命[1]。随着医学及生物科学的逐步发展，食管癌的研究逐渐深入。食管癌发生、发展的致病基因不断被发现，其发病机制的研究已成为目前医学研究领域的热点。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型14（tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 14，PTPN14）是由PTPN14基因编码的酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPs）家族的成员之一。PTPs可参与调控多种细胞过程，包括细胞增殖、分化及有丝分裂，甚至恶性转变[2]。然而PTPN14在食管癌细胞中的作用及机制，目前尚未有研究报道。本研究阐明过表达食管癌细胞系EC9706中PTPN14的表达，发现PTPN14可抑制食管癌细胞的增殖，阻滞食管癌细胞的周期，下调细胞中YAP的表达，为寻找食管癌的致病分子及进一步阐明食管癌的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RNA逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，Trizol裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，PTPN14质粒及对照载体购自北京普如汀生物技术有限公司，LipofectamineTM2000转染试剂购于美国Invitrogen公司，小鼠抗人单克隆PTPN14、YAP、βactin的一抗购自英国Abcam公司，羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥科技有限公司，四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]试剂盒购自美国Promega公司，食管癌细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 食管癌细胞系EC9706用含100 ml/L胎牛血清的改良伊格尔培养基培养，37℃、50 ml/L二氧化碳CO2细胞培养箱中培养。当细胞达70%～80%融合度后，将PTPN14质粒及对照载体经LipofectamineTM2000转入EC9706细胞中，具体操作步骤参见脂质体试剂说明书。将转染后食管癌细胞分别为PTPN14-vetor组和PTPN14-NC组。

1.2.2PTPN14基因表达水平检测 待食管癌细胞转染48 h后，收集细胞，用Trizol裂解细胞，分别提取细胞总RNA，逆转录为cDNA作为模板。根据PTPN14（NM_005401）序列设计引物，正向引物：5'-TCTAGGATGTGTGCCAGGGA-3'；反向引物：5'-TGT GGTGCTTCCGGAAATGTRT-3'。产物长度为 123 bp，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的反应条件为：95℃预变性 3 min，95℃变性 15 s，59℃退火 35 s，共39个循环，实验重复3次。

1.2.3 PTPN14和YAP蛋白表达水平检测 收集转染后48 h细胞，胰酶消化后，离心，弃上清液，加入细胞裂解液，冰上裂解45 min，4℃、10 000 r/min离心20 min，取部分上清行蛋白质定量，其余加入上样缓冲液，100℃煮沸5 min变性，取上述变性蛋白30 μg，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，半干转方式将蛋白质电转移至硝酸纤维素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上。室温封闭2 h。分别加入 PTPN14、YAP、β-actin 的一抗，4℃过夜，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，6 min/次，加入二抗，室温孵育1.5 h，PBS洗涤3次，6 min/次；加入显色剂显色、成像。

1.2.4 MTT法检测细胞的增殖 细胞转染48 h后，取对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，以4.0×103个/孔细胞密度接种于96孔板，每组7个复孔，分别培养1～5 d，每24 h取出96孔板，向每孔中加入浓度为1.5 g/L MTT 20μl，培养4 h后，再向每孔加入二甲基亚砜150 μl，读值并绘制生长曲线。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 取转染48 h后的PTPN14-vetor组和PTPN14-NC组细胞，制备细胞悬液，用5 ml PBS，1 000 r/min离心5 min，反复洗涤3次后，弃上清液；加入1 ml 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12 h，PBS洗涤，去乙醇，1 000 r/min离心5 min，洗3遍。PBS重悬细胞，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）和核糖核酸酶A至终浓度50 μg/ml，37℃温浴30 min。利用流式细胞仪检测细胞周期。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染PTPN14质粒上调EC9706细胞中PTPN14基因表达水平

转染空载体及PTPN14质粒于食管癌EC9706细胞48 h，分别提取各组细胞总RNA，各自逆转录为 cDNA，qRT-PCR检测各组 PTPN14的表达，PTPN14-vetor组与PTPN14-NC组的PTPN14表达水平比较，经两独立样本t检验，差异有统计学意义（t=13.714，P=0.007），PTPN14-vetor组高于 PTPN14-NC组。见图1。

2.2 转染PTPN14质粒增强EC9706细胞中PTPN14蛋白表达水平

转染空载体及PTPN14质粒于食管癌EC9706细胞48h，分别提取各组细胞总蛋白，Western blot检测各组PTPN14的表达，发现PTPN14-vetor组的PTPN14表达较PTPN14-NC组上升。见图2。

2.3 转染PTPN14质粒抑制EC9706细胞的增殖

MTT检测转染空载体与PTPN14质粒的EC9706细胞增殖情况。结果显示，从检测后第3天开始，PTPN14-vetor组的细胞增殖与PTPN14-NC组比较，经两独立样本t检验，差异有统计学意义（t=8.265，P=0.014）。见图 3。

2.4 转染PTPN14质粒阻滞EC9706细胞周期

流式细胞术检测转染空载体与PTPN14质粒的EC9706细胞周期情况。结果显示，PTPN14-NC组G1期比例为（48.45±7.24），PTPN14-vetor组 G1期比例为（62.79±5.87），经两独立样本t检验，差异有统计学意义（t=10.586，P=0.011），转染 PTPN14-vetor组的EC9706细胞周期被阻滞在G1期。见图4。

2.5 转染PTPN14质粒下调EC9706细胞中YAP的表达

Western blot检测转染空载体与PTPN14质粒的EC9706细胞中YAP的表达。结果显示，与PTPN14-NC组比较，转染PTPN14-vetor组EC9706细胞中YAP的表达降低。见图5。

图1 转染PTPN14质粒上调EC9706细胞中的PTPN14基因的表达水平 （±s）

图2 转染PTPN14质粒增强EC9706细胞中PTPN14的蛋白表达水平

图3 转染PTPN14质粒与空载体的EC9706细胞增殖情况

图4 转染PTPN14质粒与PTPN14空载体的EC9706细胞周期

图5 转染PTPN14质粒与空载体的EC9706细胞中YAP的表达

3 讨论

1995年，科学家在寻找正常乳腺组织中表达的酪氨酸磷酸酶时，PTPN14首次被克隆发现[3]。其是非受体酪氨酸磷酸酶家族的蛋白成员之一。研究显示，PTPN14在乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中存在突变[4-6]。在小鼠胰腺肿瘤的基因分析研究中发现，PTPN14表达明显下调（P＜10～10.8）[7]。浸润性乳腺癌组织中PTPN14表达明显降低，敲低PTPN14可以促进乳腺癌细胞发生侵袭、转移[8]。此外，PTPN14一直被认为参与细胞的增殖调控。有研究显示，PTPN14为micro RNA-21（miR-21）的直接靶基因，在肝内胆管癌中miR-21过表达，并靶向作用于PTPN14使其下调，从而促进肝内胆管癌细胞的增殖，抑制细胞的凋亡[9]。本研究探索PTPN14对食管癌细胞增殖的影响，发现过表达食管癌细胞中PTPN14可以明显阻滞细胞周期，抑制细胞增殖，证实在食管癌中PTPN14对细胞增殖有重要调控作用。

Hippo信号通路是目前研究热点之一，在进化过程中高度保守。在哺乳动物中，Hippo信号通路上游的膜蛋白受体感受到细胞外的生长抑制信号后，经过一系列激酶的磷酸化反应，最终作用于下游效应分子YAP/TAZ使其滞留于胞质内，不能入核行使功能。然而，未被抑制的YAP/TAZ将会进入细胞核，作为共激活因子或转录因子调节下游基因的表达，调控细胞的生长、增殖及凋亡[10]。YAP/TAZ作为Hippo信号通路的主要效应分子，是一种致癌蛋白，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，可作为肿瘤诊断及预后判断的独立标志物[11]。有研究显示，PTPN14可以通过Hippo信号通路参与癌症的形成和发展。WILSON等[12]研究显示，PTPN14可以通过PPXY结构域与Kibra蛋白质的WW结构域相互作用，PTPN14与Kibra结合可以诱导LATS1的激活；此外，PTPN14还可以增加LAST1蛋白质的稳定性，而LATS1的激活可以抑制YAP的致癌功能。有研究发现，在乳腺上皮细胞中PTPN14通过与YAP结合从而负调控YAP，下调PTPN14，可以导致YAP的异常表达，从而引起细胞发生恶变[13]；PTPN14也可以通过PPXY结构域与YAP蛋白质的WW结构域相互作用形成复合物，并抑制YAP介导的转录功能[14]。本研究探索食管癌中PTPN14对YAP的影响，发现过表达PTPN14可以明显抑制YAP的表达，提示在食管癌中PTPN14很可能通过抑制YAP参与调控细胞的增殖。

综上所述，本研究通过转染PTPN14质粒过表达食管癌细胞中PTPN14的表达，检测PTPN14对食管癌细胞系增殖周期的作用，以及对YAP表达的影响。研究发现，过表达PTPN14可以抑制食管癌细胞增殖，阻滞食管癌细胞周期，抑制YAP的表达。研究结果表明，PTPN14在食管癌增殖周期中发挥重要作用。本实验结果为进一步研究PTPN14在食管癌发生、发展中的作用提供理论基础，为食管癌的治疗提供新的分子靶标。

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（童颖丹 编辑）

PTPN14 inhibits proliferative ability of esophageal cancer cells via hippo/YAP pathway*

Hua-song Liu1,Lan-lan Xu2,Jun Zhang1,Jia-long Guo1,Chen-yi Lin1,Ye Yuan1,Min Zeng1,Dong-liang Cheng1
(1.Department of Thoraco-cardio-macrovascular Surgery,the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442099,China;2.Shool of Nursing,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000,China)

ObjectiveTo investigate the tumor-suppressing role of protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 14 (PTPN14)in esophageal carcinoma and the mechanism.MethodsEC9706 cells were transfected with PTPN14 over-expression vector,and then PTPN14 expression in the EC9706 cells was detected by qRT-QPCR and Western blot.The proliferation of the EC9706 cells was analyzed by MTT.The cell cycle of the EC9706 cells was analyzed by flow cytometry.The expression of YAP was detected by Western blot.ResultsThe expression level of PTPN14 was significantly upregulated in the EC9706 cells transfected with PTPN14 over-expression vector.After transfection,the proliferation of EC9706 cells was inhibited,the cell cycle was blocked at G1,and YAP expression was decreased.ConclusionsPTPN14 may block cell cycle and inhibit proliferation of esophageal cancer cells by down-regulation of YAP.

protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14;YAP;proliferation;esophageal cancer

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.005

1005-8982（2017）17-0025-04

2016-04-06

湖北省教育厅项目（No：B2016497）

张军，E-mail：zhjun159@sina.com；Tel：13508684276