青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜血管新生的影响*

石宇红，彭琼，任亚飞，许佳，李丽梅，李宝贞，莫汉有

（桂林医学院附属医院 风湿免疫科，广西 桂林 541002）

基础研究·论著

青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜血管新生的影响*

石宇红，彭琼，任亚飞，许佳，李丽梅，李宝贞，莫汉有

（桂林医学院附属医院 风湿免疫科，广西 桂林 541002）

目的观察青藤碱对Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型大鼠（CIA）低氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）及基质金属蛋白9（MMP-9）的影响，探讨青藤碱对类风湿关节炎（RA）滑膜血管新生的作用机制。方法40只远交群大鼠，随机选取10只作为对照组，余30只大鼠采用尾根部皮下注射Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂的方法复制关节炎模型。15 d后造模大鼠随机分为模型组、雷公藤组、青藤碱组，每组10只。雷公藤组：雷公藤多甙片9.68 mg/（kg·d）灌胃给药；青藤碱组：青藤碱片100 mg/（kg·d）灌胃给药；模型组灌服等体积0.9%氯化钠注射液。1次/d，共28 d。期间测量大鼠踝关节肿胀度。灌药28 d后处死大鼠，免疫组织化学法检测关节滑膜组织HIF-1α水平，酶联免疫吸附试验测定血清中VEGF、MMP-9水平。结果与模型组比较，青藤碱组和雷公藤组大鼠关节肿胀度减轻（P＜0.05）；青藤碱组和雷公藤组滑膜组织中HIF-1α表达降低（P＜0.05）；青藤碱组和雷公藤组血清中VEGF、MMP-9表达降低（P＜0.05）。结论青藤碱可降低CIA踝关节肿胀，疗效与雷公藤多甙相当。其机制可能是通过下调HIF-1α的表达及VEGF、MMP-9水平，从而减少滑膜新生血管生成。

青藤碱；Ⅱ型胶原诱导性关节炎；低氧诱导因子1α；基质金属蛋白9

新生血管翳是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）关节破坏的关键。目前研究发现，血管新生与低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）[1]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[2-3]、基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）[4]有关，其共同作用可影响新生血管的形成。

青藤碱是从青风藤中提取的单体，其对RA、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病有较好的治疗作用。本研究通过复制Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠（collagen-induced arthritis rats，CIA）模型，探讨青藤碱对模型大鼠HIF-1α、VEGF及MMP-9的影响和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用清洁级远交群（sprague dawley，SD）大鼠，雄性，40只，体重120～160 g。由桂林医学院实验中心提供（动物许可证号：SYXK桂2013-0001）。在桂林医学院实验中心动物室适应性饲养1周。

1.2 药品与试剂

青藤碱（正清风痛宁片，湖南正清制药集团股份有限公司，批号：Z43020278），雷公藤多甙片（浙江得恩德制药有限公司，批号：Z33020422），牛Ⅱ型胶原（美国Chondrex公司），不完全弗氏佐剂（美国Sigma公司），HIF-1α小鼠单克隆抗体（美国Thermo公司），羊抗鼠二抗（福州迈新生物工程有限公司），逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（大连宝生生物工程有限公司），VEGF试剂盒（南京建成生物工程研究所），MMP-9试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

1.3 实验仪器

基因扩增仪（德国Biometra公司），凝胶电泳结果图像分析仪（上海培清JS-780），可调式微量移液器（德国Eppendorf公司），光学显微镜及照相系统（日本Olympus公司，IX71），病理组织切片机（德国LEICA RM公司，2025），高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，5804R），微量台式高速冷冻离心机（美国Thremo公司）。

1.4 动物模型的复制及分组

健康雄性SD大鼠40只，适应性喂养1周后，随机选取10只作为对照组，其余30只复制Ⅱ型CIA大鼠模型。取适量浓度为2 mg/ml牛Ⅱ型胶原溶液逐滴加入等容积的弗氏不完全佐剂中，牛Ⅱ型胶原终浓度调整为1 mg/ml。用匀浆器在冰浴中充分乳化至滴加水中不扩散，取乳化后的混合物按200 μg/只，于尾根部皮下注射，7 d后按牛Ⅱ型胶原100 μg/只，尾根部皮下加强免疫1次。免疫15 d后，将大鼠分为模型组、雷公藤组、青藤碱组，每组10只。

1.5 给药方法及样本制备

分组后开始灌胃给药，对照组正常条件下喂养，不做任何处理；模型组给予0.9%氯化钠注射液100.00 mg/（kg·d）；雷公藤组给予雷公藤多甙片9.68 mg/（kg·d）；青藤碱组给予青藤碱片100.00 mg/（kg·d）。以上药物均连续灌胃28 d。28 d后戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，2 500 r/min离心20 min，取血浆，分装后置入-80℃冰箱冷冻保存备用。取腕关节、膝关节或踝关节的滑膜组织于4%多聚甲醛中固定。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 关节肿胀度测量 第1次免疫前在大鼠后肢踝关节上方0.5 cm处进行标记，分别于免疫前及给药完成后用足趾容积测量仪测量踝关节排水体积，计算关节肿胀度。肿胀度=（Vt-Vo）/Vo×100%，Vo为造模前的容积，Vt为给药完成后的容积。

1.6.2 滑膜病理学评分 留取血样后处死大鼠，取腕关节、膝关节或踝关节放入4%多聚甲醛固定16 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脱钙，常规脱水、浸蜡、包埋切片、苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。光镜下观察关节滑膜增生、滑膜下炎症程度及血管翳生成情况。滑膜微血管检测：每个标本在100倍光镜下随机抽取5个视野做毛细血管计数，以5个视野计数的均值作为每个标本的血管计量指标。微血管密度结果判定：低倍镜下找到病灶中微血管最密集（热点）的3个区，高倍镜（400倍）下计数该3个区的微血管数或微淋巴数，取3个高倍镜下的微血管数平均值。

1.6.3 免疫组织化学法检测HIF-1α的表达 滑膜组织切片先脱蜡、水化，0.01 mol/L、pH 6.0柠檬酸微波修复，3%双氧水H2O2封闭，正常山羊血清封闭，加一抗，40℃过夜；加二抗，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，加二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色液，冲洗、复染、封片、镜检。HIF-1α阳性细胞为在胞质或胞核中可见黄色或棕褐色阳性产物的细胞。每张切片随机检测10个高倍镜视野。①阳性细胞所占比例评分：阴性为0分，＜10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为 4分。②按阳性着色程度评分：无着色、与背景色一致为0分，浅黄色略高于背景色为1分，棕黄色、明显高于背景色为2分，棕褐色为3分。③两者乘积判定阳性结果。

1.6.4 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测VEGF 浓缩洗涤液用双蒸水稀释，加入血浆标本稀释液1.0 ml至标准品中，待彻底溶解后，静置15 min混匀（浓度为2 μg/L），然后根据需要进行稀释。以生物素化抗体稀释液稀释生物素化抗体，以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物。要求注入自动洗板机的洗涤液为350 μl，注入与吸出间隔15～30 d，洗板4次。除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品（100μl/孔）加入相应孔后用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90 min，洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液（100μl/孔），用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60 min，洗板4次。除空白孔外，加入酶结合物工作液（100μl/孔），封住板孔，37℃孵箱孵育30 min，洗板4次。加入底物显色剂100 μl/孔，37℃避光孵育15～20 min（视颜色深浅灵活掌握），加入终止液100μl/孔，混匀后即刻（5 min内）测量450 nm处吸光度值。

1.6.5 ELISA法检测MMP-9的表达 采用血浆样品，肝素锂抗凝。其余步骤同VEGF。经稀释后加至预经单抗或明胶包被的反应微孔，37℃温育反应2 h，洗涤5次后加入辣根过氧化物-亲和素偶联物，37℃、30 min；再洗涤 5 次后加入 100 μl/孔 3，4，5-三甲氧基苯甲醛底物液室温反应10～15 min，最后加入50 μl 1.8 mol/L盐酸终止反应。根据标准曲线计算MMP-9表达量。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠关节肿胀度比较

造模后第15天除对照组外，其他3组大鼠踝、跖趾关节及趾关节出现不同程度红肿，用药28 d后，对照组、模型组、雷公藤组、青藤碱组大鼠关节肿胀度分别为（11.21±3.12）%、（67.46±13.72）%、（31.46±12.57）%和（38.51±13.86）%，各组关节肿胀度比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=8.293，P=0.001）。模型组与对照组的关节肿胀度比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=24.311，P=0.000），青藤碱组、雷公藤组与模型组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=2.456和2.919，P=0.015和0.004），青藤碱组和雷公藤组关节肿胀度比模型组低，药物干预作用明显。

2.2 大鼠踝关节病理学变化

HE染色结果显示，对照组大鼠滑膜细胞扁平形，排列整齐，有少量纤维及毛细血管，关节结构完整，软骨层表面光滑，无结构破坏。模型组大鼠滑膜细胞层明显增多，滑膜细胞水肿，排列紊乱，部分滑膜组织可见呈绒毛状增生，炎症细胞及纤维细胞浸润，有较多毛细血管，关节软骨粗糙，关节腔内有纤维素样渗出。雷公藤组滑膜细胞排列尚整齐，纤维组织轻度增生，可见少量炎症细胞，血管增生不明显，关节软骨表面基本光滑，关节腔纤维素样渗出不多。青藤碱组滑膜细胞层数较模型组增多，达到5、6层，有少量炎症细胞存在，较雷公藤组稍增多，关节软骨组织有轻度破坏。各组各项病理学评分比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组与对照组病理学评分（总分、滑膜增生、炎症细胞浸润、新生血管数）比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=14.321、9.425、8.923 和 9.425，均P=0.000），青藤碱组与模型组病理学评分（总分、滑膜增生、炎症细胞浸润、新生血管数）比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=2.162、2.131、2.836 和 2.126，P=0.041、0.042、0.021和0.045）。见表1和图1。

2.3 青藤碱对Ⅱ型CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白表达的影响

免疫组织化学法结果显示，HIF-1α蛋白在正常关节组织中不表达或仅有微弱表达，而在低氧状态下则在胞质或胞核中可见黄色或棕褐色的阳性产物。对照组基本没有HIF-1α蛋白表达；模型组有HIF-1α阳性物质在细胞质或细胞核中高表达，呈深褐色，尤其是位于滑膜最外层细胞；而雷公藤组和青藤碱组HIF-lα轻度表达。采用半定量积分法进行分析，对照组、模型组、雷公藤组、青藤碱组大鼠HIF-1α 蛋白表达量分别为（1.422±0.783）、（7.354±2.548）、（3.122±1.178）和（3.743±1.624），经方差分析，差异有统计学意义（F=13.781，P=0.000）。模型组与对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=11.345，P=0.000），青藤碱组、雷公藤组与模型组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=2.358和 2.615，P=0.024 和 0.011）。见图 2。

表1 各组大鼠滑膜病理学评分比较 （n=10，分，±s）

表1 各组大鼠滑膜病理学评分比较 （n=10，分，±s）

注:†与模型组、对照组比较，P＜0.05

组别 总分 滑膜增生 炎症细胞浸润 新生血管数对照组 0.093±0.035 0.021±0.008 0.031±0.009 0.023±0.002模型组 0.782±0.095 0.517±0.013 0.137±0.062 0.218±0.145青藤碱组 0.563±0.168†0.275±0.129†0.106±0.028†0.161±0.163†雷公藤组 0.457±0.211†0.246±0.137†0.095±0.031†0.147±0.153†F值 14.985 10.468 6.729 8.873P值 0.000 0.000 0.000 0.001

图1 大鼠踝关节腔病理学改变 （HE×200）

图2 大鼠关节滑膜组织HIF-1α的表达 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法×200）

2.4 CIA大鼠外周血中VEGF和MMP-9的水平

各组外周血VEGF、MMP-9水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=42.563和38.956，均P=0.000）。模型组与对照组的VEGF、MMP-9水平比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=14.332和5.314，均P=0.000），青藤碱组与模型组的VEGF、MMP-9水平比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=2.033和5.821，P=0.040和 0.013）。见表 2。

表2 各组大鼠外周血中VEGF和MMP-9的表达比较（n=10，μg/L，±s）

表2 各组大鼠外周血中VEGF和MMP-9的表达比较（n=10，μg/L，±s）

注：†与模型组、对照组比较，P＜0.05

组别 VEGF MMP-9对照组 28.6±5.4 16.2±4.8模型组 135.7±18.5 82.4±9.3雷公藤组 74.8±10.3†40.6±8.5†青藤碱组 68.2±11.3†42.5±10.1†F值 42.563 38.956P值 0.000 0.000

3 讨论

RA是我国常见的自身免疫性疾病之一，严重者可导致人群丧失劳动力和致残，严重影响患者的生活和生存质量。目前其发病机制仍未完全明确。基于RA的主要病理改变是在炎症的刺激下，大量炎症细胞增生、浸润，关节滑膜充血、水肿、组织疏松，毛细血管通透性增高，纤维素及浆液渗出至关节腔内，滑膜细胞合成包括肿瘤坏死因子及白细胞介素等多种细胞因子，促进关节滑膜成纤维细胞增殖和微血管新生，滑膜血管翳形成，继而侵蚀软骨与骨组织，造成关节结构破坏，最终导致关节畸形及功能损害[5-7]。新生血管形成和细胞外基质降解是RA病理过程的核心环节，控制新生血管形成和细胞外基质降解成为控制RA关节软骨侵蚀破坏的关键。VEGF是已知的最强刺激血管新生的因子之一，在血管新生中发挥核心调控作用[8-9]。在血管的发育过程中，HIF-1对血管新生也起重要作用，通过抑制HIF-1α的降解，可使VEGF表达增加，最终导致缺血组织的血管新生[10]。既往研究也发现，CIA大鼠模型中滑膜组织有HIF-1α高表达，并与炎症程度呈正相关[11]。在缺氧条件下RA患者滑膜细胞HIF-1α与VEGF表达增高密切相关，提示HIF-1α-VEGF信号途径在类风湿炎的发生、发展中起重要作用。MMP-9是一类可有效降解细胞外基质和细胞膜成分的蛋白水解酶，同时通过释放生长因子、趋化因子及细胞因子等，参与人体许多生理及病理过程。在对肿瘤血管新生的研究中已经发现，MMP-9可在卵巢上皮癌过度表达，促进肿瘤血管的生成[12]。在对类风湿关节炎的研究中也发现，在MMP-9的作用下可出现滑膜衬里细胞增生、大量炎症细胞浸润、滑膜下细胞增生及滑膜下层血管生成，导致增生的滑膜组织向软骨面生长，形成血管翳，从而出现关节破坏[13]。提示MMP-9在关节滑膜血管新生的过程中也发挥重要作用。

青风藤在我国用于治疗类风湿关节炎的历史悠久，青藤碱是从中药青风藤中提取的单体生物碱，具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用，现已用于RA的治疗。目前研究发现，青藤碱可通过下调T细胞转铁蛋白受体表达，减少细胞对铁离子的摄入，从而抑制T细胞的活化与增殖；还可减少白细胞介素6的产生，抑制B细胞的活化，从而抑制关节免疫炎症和关节破坏作用[14]。其还可以通过抑制滑膜细胞产生炎症介质，如TNF-α、IL-1β、致炎因子干扰素-γ及一氧化氮等，发挥其抗炎镇痛的效果[15-17]；并且青藤碱可提高CIA大鼠外周血OPG水平，OPG/RANKL比值升高，提示其有骨保护作用[16]。但对于血管新生方面的研究，国内研究较少。本研究初步讨论青藤碱对HIF-1α、VEGF及MMP9的影响，为青藤碱多种药理学的免疫研究提供依据。

本实验对CIA大鼠模型给予雷公藤多甙和青藤碱治疗后，发现青藤碱可以降低CIA大鼠的关节肿胀程度，并且在光镜下也看到其对滑膜血管新生有抑制作用，其作用与雷公藤多甙效果相当。HIF-1α的表达水平提示其可降低HIF-1α在滑膜的表达，结合对外周血VEGF和MMP-9的检测，显示青藤碱可降低VEGF和MMP-9的表达，效果与雷公藤多甙相当。因此笔者认为，青藤碱的抗风湿机制除前面所说的免疫抑制和抗炎镇痛等作用外，还有可能通过影响HIF-1α、VEGF及MMP-9的表达，抑制血管新生，从而减少滑膜血管翳的生成，减少关节破坏。

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（童颖丹 编辑）

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投稿细则

Effect of Sinomenine on synovial angiogenesis in rats with collagen-induced arthritis*

Yu-hong Shi,Qiong Peng,Ya-fei Ren,Jia Xu,Li-mei Li,Bao-zhen Li,Han-you Mo
(Department of Rheumatology and Immunology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541002,China)

ObjectiveTo observe the effect of Sinomenine on the expression of hypoxia-inducible factor-1 α (HIF-1α),vascular endothelial growth factor (VEGF)and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9)in rats with typeⅡcollagen-induced arthritis(CIA),and to explore its therapeutic roles and mechanism.MethodsTotally 40 male SD rats were recruited,among which 10 were randomly selected as the normal control group.The CIA model was established in the rest 30 rats by subcutaneous injection of typeⅡ collagen of bovine emulsion in the tail root and induction of incomplete Freund's adjuvant.On day 15 primary immunization rats were randomly divided into 3 groups,i.e.model group,Tripterygium Glycosides(TG)group(at a daily dose of 9.68 mg/kg body weight),and Sinomenine(SIN)group(at a daily dose of 100 mg/kg body weight),10 in each group.The corresponding medication was given to the rats of each group by gastrogavage once daily for 28 days.An equal volume of sodium chloride injection was given to the rats in the normal control group and the model group by gastrogavage,once daily for 28 successive days.The swelling degree of the joints was measured.The rats were sacrificed after 28-day treatment.Plasma levels of VEGF and MMP-9 were measured with ELISA.The expression of HIF-1α in synovium was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the swelling degree of the joints was significantly alleviated in the TG group and the SIN group (P＜0.05),the HIF-1α expression obviously decreased in the synovium of theTG group and the SIN group(P＜0.05),the plasma levels of VEGF and MMP-9 were lower in the TG group and the SIN group (P＜0.05).ConclusionsSIN could markedly alleviate the swelling degree of joints in the CIA model rats.Its therapeutic efficacy is equal to that of TG.Its mechanism might be by down-regulating the HIF-1α expression in joints and the plasma levels of VEGF and MMP-9,thereby reducing synovial neovascularization.

Sinomenine;type Ⅱ collagen-induced arthritis;hypoxia-inducible factor-1α;vascular endothelial growth factor;matrix metalloproteinase-9

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R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.001

1005-8982（2017）17-0001-06

2016-07-05

国家自然科学基金（No：81460257）；广西中医药管理局课题（No：gzzc1238）；广西省桂林市攻关课题（No：20140120-1-2）