SCN1A基因突变阴性热性惊厥患者SCN3A基因突变的特点*

2017-09-01陈勇军刘稀金廖卫平郭静李欣易毅利

中国现代医学杂志 2017年17期

陈勇军，刘稀金，廖卫平，郭静，李欣，易毅利

（1.南华大学附属南华医院神经内科，湖南衡阳 421002；2.广州医科大学附属第二医院神经科学研究所，广东广州 510120；3.广东省佛山市第一人民医院神经内科，广东佛山 528000）

陈勇军1，刘稀金1，廖卫平2，郭静3，李欣1，易毅利1

目的对SCN1A基因突变阴性的热性惊厥（FS）患者进行SCN3A基因突变筛查，并分析其突变特点。方法应用聚合酶链反应扩增和Sanger测序方法对38例入组患者筛查SCN3A基因突变，采用生物软件分析突变特点。结果2例错义突变（c.956T＞C/p.I319T，c.5179G＞A/p.D1727N）；同源性比对分析提示2例突变均高度保守，在千人基因组计划数据库和100例正常人中未发现相应的位点改变。结论在SCN1A基因突变阴性的FS患者中，发现2例SCN3A基因突变错义突变，该突变可能具有致病性。

热性惊厥；SCN1A基因；SCN3A基因；筛查

热性惊厥（febrile seizures，FS）是儿童期很常见和具有代表性的癫痫发作，与发热及年龄相关，多在体温＞38.5℃发作，一般3个月～6岁发病，患病率为3%～5%，发作形式多为强直阵挛发作。电压门控钠离子通道基因突变是热性惊厥的最常见病因，在家族性患者中更为多见[1]。癫痫是由于脑部神经元电活动异常而导致的短暂、发作性疾病。离子通道基因突变能够导致神经细胞动作电位的产生和传播发生改变，因而与癫痫的发生密切相关。SCN1A基因是与热性惊厥关系最为密切的基因，国内外研究最多，迄今发现突变位点最多，已经＞1 000个[2-6]。SCN1A和SCN3A基因为钠通道的不同亚型，基因定位相似，主要分布在大脑神经元的胞体部位，功能特性上具有相似性，然而对于SCN3A与热性惊厥或相关性癫痫关系的报道仍然很少[7-11]。对于SCN1A基因突变阴性的患者，可能存在其他致病基因的突变，本文拟收集SCN1A基因突变阴性的热性惊厥患者，进行SCN3A基因筛查，并初步分析其致病性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年6月-2016年6月南华大学附属南华医院神经内科和小儿科就诊的FS患者38例。纳入标准：①起病年龄3个月～6岁，急性发热（体温≥38.5℃）而诱发的全面性强直阵挛发作；②热性惊厥持续到6岁后，或出现无热惊厥，发作形式为部分性和或全面性发作；③性别及就诊年龄不限；④排除颅内感染、脑损伤等疾病；⑤已行SCN1A基因筛查未见突变。选取100例健康志愿者作为正常对照组。本研究经医学伦理委员会批准，入组对象签署知情同意书。参照BAULAC[12]和LIAO等[13]的描述对入组患者进行分类诊断。热性惊厥：3个月～6岁，只在发热时出现惊厥发作，无热时无发作，未用药物或简单少量的抗癫痫药即能完全控制发作，6岁后不再发作，智能发育无异常；热性惊厥附加征（febrile seizures plus，FS+）：3个月～6岁有 FS或无热惊厥，6岁后仍有热性或无热发作；部分性癫痫伴热性惊厥附加征（partial epilepsy with febrile seizures plus，PEFS+）：符合FS+患者，发作形式只有部分性或部分继发全面性发作，脑电图表现多为局灶性异常；全面性癫痫伴热性惊厥附加征（generalized epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+）：符合 FS+ 患者，临床表型只有全面性发作；婴儿重症肌阵挛性癫痫（severe myoclonic epilepsy in infancy，SMEI）：1 岁内起病，起病前精神运动发育无异常，起病时表现为热性和无热的单侧或双侧阵挛或强直阵挛发作，起病后出现肌阵挛发作等多种发作形式，但以部分性发作为主，且伴精神运动发育迟滞，脑电图表现为局灶性、多灶性甚至广泛的异常，治疗效果不好，预后差。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取收集患者和健康志愿者的外周静脉血4 ml，采用美国傲锐基因技术有限公司提供的Quick-Gene-610L和Quick Genen Mini 80基因组DNA快速提取试剂盒抽提DNA，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。

1.2.2 引物合成参照文献[7]合成引物，序列覆盖所有外显子编码区和内含子-外显子剪切区，由上海生工生物工程股份有限公司合成，转录本号为NM066922。

1.2.3 筛查方案聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增SCN3A基因全部外显子，使用广州东盛生物科技有限公司的Taq DNA酶和2×HSTMReaction Mix冰上配置PCR体系（基因组200 ng+正反向引物各5 μl+Mix 25 μl+Taq酶0.5 μl+ddH2O至50μl，引物工作浓度为10μmol/L），取3 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带单一且清晰，取剩余PCR产物连同引物送至深圳华大基因有限公司测序。采用Vector-NTI-V8.0生物软件进行序列比对，若发现突变位点则扩增100例正常人同一片段进行测序对照，为判断突变来源，收集患者双亲血液验证。

1.2.4 生物软件分析对于发现的突变位点，采用Clustalx1行保守性分析及Mutation Taster软件预测其致病性（网址http：//www.mutationtaster.org，输入SCN3A基因名称，选择转录本NM_006922，输入突变后的碱基及位置，点击进入，了解在千人基因组计划数据库中的突变情况，初步判断其致病性）。

2 结果

2.1 突变位点及致病性分析

纳入38例SCN1A基因阴性的热性惊厥患者，发现2例杂合错义突变（c.956T＞C/p.I319T，c.5179G＞A/p.D1727N）。c.956T＞C导致第319位的氨基酸残基遗传密码子上第2个碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶取代（ATT→ACT），导致异亮氨酸变为苏氨酸。该突变位于第6号外显子上，双亲DNA验证来源于父亲。c.5179G＞A导致1727位氨基酸残基遗传密码子上第1个碱基鸟嘌呤被腺嘌呤取代（GAC→AAC），导致天冬氨酸变为天冬酰氨，位于第26号外显子上，父母亲中未发现相同位点改变，提示为新生突变。2个错义突变都位于在钠离子通道的孔区，前者在DⅠS5-S6，后者在DⅣS5-S6。在人的分布于神经系统钠通道亚型中（如SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN8A、SCN9A、SCN10A），以及哺乳动物狗、大鼠小鼠中序列一致。同源性分析提示保守性高，两者在100例正常对照组中未发现同样的变异，Mutation Taster软件分析在千人基因组计划中未发现相应的突变位点，提示两者都可能具有致病性。见图1、2。

图1SCN3A基因突变位点测序图

图2SCN3A突变位点位置示意图及保守性分析

2.2 临床资料

纳入38例患者，其中男性24例，女性14例首发年龄（3.6±0.5）岁，5例有FS家族史，33例为散发，27例智能发育差，11例智能正常。1例患者可能表现出多种发作形式，统计发作形式如下：复杂部分性发作（complex partial seizure，CPS）14 例，全面性强直阵挛发作（generalized tonic-clonic seizure，GTCS）15 例，继发性 GTCS（secondary gtcs，sGTCS）7 例，失神3例，肌阵挛4例，强直8例，阵挛5例，3例有癫痫持续状态等。脑电图有局灶性棘慢波发放的12例，全面性棘慢复合波15例，未见放电的7例，其他4例。影像学有异常提示10例，表现为大脑皮质发育不良、皮质局灶性低密度影、海马萎缩等。药物以丙戊酸钠口服液使用最多，其次奥卡西平、卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯及氯硝西泮等，单药治疗控制较好的12例，其余使用二联或＞3种药物。分类诊断FS 4例，FS+7例，PEFS+9例，GEFS+8例，SMEI 10例。

2例突变患者病史如下：1例为男性，3岁时在体温39℃首次发作，表现为全面性大发作，此后发热就有发作，6岁以后不发热也有发作，脑电图提示为全面性慢波，MRI未见异常，诊断为GEFS+，服用过苯妥英钠、卡马西平效果差，加丙戊酸钠后发作减少，其父亲2岁时有FS，此后未有再发；另外1例为女性，3.5岁首发，体温38.5℃，表现为部分性发作为主，间断全面性发作，此后多次发作。6岁仍然有发作，与发热无关，其姑妈2～5岁时有FS，此后未再发。MRI提示左侧海马信号略高，脑电图示局灶性慢波发放，临床诊断PEFS+，服用奥卡西平、左乙拉西坦、拉莫三嗪等药物发作减少。2例患者智商分别为45和27分，提示存在中度或重度智能障碍，尤其是语言功能明显受损。

3 讨论

大家系连锁分析揭示FS是常染色体显性遗传模式，目前已经将FS相关基因定位扩大到11个染色体位点上，命名为FEB1～FEB11，其中位点FEB3（2q23～24）与SCN1A和SCN3A基因在2号染色体上的簇集位置一致[14]。SCN1A基因突变已明确是FS相关性癫痫的主要致病原因，SCN3A基因与SCN1A的位置相近，都分布于中枢神经系统，亚细胞定位于神经元的胞体和树突，但是SCN3A突变与FS的相关性未引起重视，研究报道很少。2009年国内王鹏[8]首先在伴有智能障碍的热性惊厥患者中发现2例SCN3A基因突变（A463V，D998E），其后郭静[9]发现4例突变（A201V、N302S、R520T及 D530G），其中D530G是在27例SCN1A基因突变阳性患者中发现，提示SCN3A基因突变率与SCN1A相比较非常低。VANOYE等[10]在局灶性癫痫患儿发现M1323V突变，该突变可能是国外第1个报道SCN3A基因与FS相关的突变位点，患者16个月大时仅表现为单纯性FS发作。

不管是FS患者还是其他遗传性疾病患者，同时存在≥2种基因突变的情况极为少见，其发病机制可能也更为复杂，其致病性可能以其中一种为主，另一种起修饰作用，加强或者减弱前者的致病性。SCN1A基因突变阴性的FS患者可能存在其他基因突变，本文对38例患者施行SCN3A筛查，发现2例错义突变，突变率仅为5.26%（2/38），100例正常对照组未发现相同位点改变。生物软件分析表明，2个突变点保守性高，在千人基因组计划数据库和100例正常人中未发现相应的突变，提示可能为致病性突变，SCN3A基因缺陷容易导致癫痫易感性增加[15]。VECCHI等[16]利用阵列比较基因组杂交技术，发现1例癫痫患儿的2号染色体上存在12 Mb长度的钠通道集群的缺失，该缺失片段覆盖SCN3A基因，该患者同时存在FS发作和智能障碍。本研究发现的2例突变患者都存在智能障碍，即智能障碍的FS患者中SCN3A的突变率为7.41%（2/27），而在11例智能正常的患者中无一例突变发现，表明在伴有智能障碍者中的突变率高于总突变率，提示SCN3A突变可能与智能障碍相关。

FS具有明确的遗传易感性，家族性发病常见，患者同胞的患病率较普通人群高19.9%～24.9%[17]。本研究纳入患者多为散发病例，样本量较小，突变率低可能还不能反映实际情况，如果能够进一步扩大样本量、尽量收集到家系病例，突变率可能增高。钠离子通道基因发生突变后如何导致癫痫的发生，其发病机制是非常复杂的问题。突变后通道的功能发生改变，导致神经元细胞电活动异常，可能是癫痫发生的分子机制，膜片钳电生理功能研究亦是进一步研究的方向[18]。

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（童颖丹编辑）

Screening ofSCN3Agene mutations inSCN1Amutation negative patients with febrile seizures*

Yong-jun Chen1,Xi-jin Liu1,Wei-ping Liao2,Jing Guo3,Xin Li1,Yi-li Yi1
(1.Department of Neurology,Nanhua Hospital Affiliated to University of South China,Hengyang,Hunan 421002,China;2.Institute of Neuroscience,the Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510120,China;3.Department of Neurology,the First People's Hospital of Foshan City,Foshan,Guangdong 528000,China)

ObjectiveTo screenSCN3Agene mutations in patients with febrile seizures but noSCN1Amutation,and to analyze the genetic characteristics.MethodsThe mutations ofSCN3Agene were screened in 38 patients by PCR amplification and Sanger sequencing,and the genetic characteristics of the mutations were analyzed using the biological software.ResultsTwo missense mutations (c.956T＞C/p.I319T,c.5179G＞A/p.D1727N)were found.And homology comparison analysis suggested that the mutations were highly conserved,and no corresponding locus changes were found in the thousand human genome project database or in 100 normal people.ConclusionsThere are two missense mutations ofSCN3Agene in patients with negative SCN1A mutation,and theSCN3Agene mutations may be pathogenic.

febrile seizures;SCN1Agene;SCN3Agene;screening

R742.1

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.007

1005-8982（2017）17-0035-05

2017-03-02

湖南省教育厅高校科研一般项目（No：15C1206）