SKP2突变载体S72A和S72D的构建以及生物学功能研究

曲 璇,李 军,马晓军,韩洛川,史海龙

(陕西中医药大学基础医学院生物学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:quxuan519@163.com)

SKP2突变载体S72A和S72D的构建以及生物学功能研究

曲 璇*,李 军,马晓军,韩洛川,史海龙

(陕西中医药大学基础医学院生物学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:quxuan519@163.com)

目的 构建SKP2突变载体SKP2S72A和SKP2S72D并验证其生物学功能。 方法 利用一步法PCR合成含有SKP2S72A和SKP2S72D突变序列,通过酶切连接将序列插入pBabe载体中,将克隆载体转入大肠杆菌后,筛选阳性克隆进行序列测定,将鉴定正确的克隆转染HEK293细胞,并利用Western blot实验鉴定基因表达及其对靶蛋白P27的影响。 结果 PCR扩增得到序列测定结果与预期序列完全一致;构建的SKP2S72A和SKP2S72D突变质粒,用于基因转染纯度较好,在真核细胞中成功表达,并且影响了P27的蛋白水平。 结论 构建获得SKP2突变载体,为今后SKP2泛素连接酶活性的功能研究提供良好的基础。

S期激酶相关蛋白; 突变载体; 过表达载体

SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)称为S期激酶相关蛋白2,是F-box家族成员之一。研究表明,在蛋白泛素化降解过程中,SKP2发挥E3泛素连接酶的作用,通过募集泛素分子来标记靶蛋白,并实现对蛋白的降解过程,如细胞周期调控蛋白P27、P21等[1,2]。SKP2在多种肿瘤细胞中呈高表达,通过调控细胞周期、细胞增殖和迁移等过程,促进肿瘤的发生发展,如结肠癌[3]、乳腺癌[4]、黑素瘤[5]等。在细胞内,SKP2能够被PI3K/AKT信号通路的激活,其一级结构中的丝氨酸72位点能够被AKT识别并磷酸化,因此,PI3K/AKT信号通路在SKP2的活化中扮演重要角色[6,7]。为了深入研究SKP2活化对细胞生物学行为的影响,我们构建了SKP2点突变体:失活型突变体SKP2S72A和组成性活化突变体SKP2S72D,并对其表达和功能进行了验证。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

HEK293细胞源自美国模式培养物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC),并由陕西中医药大学基础医学实验室冻存;大肠杆菌XL10由陕西中医药大学基础医学实验室保存;一步法快速定点突变试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司;质粒提取试剂盒及凝胶回收纯化试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司公司产品;Lipofectamine2000及TRIzol试剂均为美国Invitrogen公司产品;反转录试剂盒为美国Promega公司产品;兔抗人SKP2:sc-7164为美国SANTA CRUZ公司产品;兔抗人p27(C-19):sc-528为美国SANTA CRUZ公司产品;小鼠抗人β-肌动蛋白(actin)单抗及Western blot试剂盒为德国Sigma公司产品。

1.2 pBabe-SKP2突变载体的构建与测序

根据已构建成功的pBabe-SKP2的过表达载体为模板,分别设计S72A和S72D的突变载体引物。S72A:上游引物:5′-ACGGAAACGGCTGAAGGCCAAAGGGA-3′;下游引物:5′-TTGTCACTCCCTTTGGCCTTCA-3′(下划线为突变碱基);S72D:上游引物:5′-ACGGAAACGGCTGAAGGACAAAGGGA-3′;下游引物:5′-TTGTCACTCCCTTTGTCCTTCA-3′(下划线为突变碱基)。PCR扩增条件为:95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s,共30个循环,72 ℃再延伸7 min;得到的PCR产物经DpnⅠ消化、ClonExpress TM重组环化后直接进行转化。待单克隆形成肉眼可见的菌落时,挑取10个单克隆,将单克隆接种于液体LB培养基中,37 ℃培养12 h,所得的菌液进行测序。

1.3 细胞转染

细胞转染操作前进行实验分4组:阴性对照组(转染pBabe阴性对照质粒)，野生型SKP2过表达组(转染pBabe-SKP2过表达质粒)，突变型SKP2S72A过表达组(转染SKP2S72A)，突变型SKP2S72D过表达组(转染SKP2S72D)。细胞转染过程如下:按Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒说明书进行操作。将5×105HEK293细胞/孔接种于6孔板,接种隔夜后取4 μg pBabe阴性对照载体、pBabe-SKP2过表达载体和pBabe-SKP2S72A和pBabe-SKP2S72D两个突变载体分别与10 μl Lipofectamine2000混匀,室温静置20 min后进行瞬时转染。

1.4 Western blot法检测蛋白表达

分别收集25 cm2培养瓶中的亲本HEK293细胞、pBabe阴性对照载体、pBabe-SKP2过表达以及pBabe-SKP2S72A和pBabe-SKP2S72D两个突变载体。首先使用冰浴的PBS清洗细胞两次,之后加入遇冷的RIPA裂解液。反复吹打细胞,直至细胞完全溶解,最后将RIPA裂解液转移至1.5 ml离心管中,放置于冰盒中,期间不时涡旋震荡,裂解细胞30 min。低温高速离心15 min,离心后将上层液体转移至新的1.5 ml离心管中,吸取一定量的样品进行蛋白定量,测出样品的蛋白浓度,余下的样品按比例加入5×loading buffer,煮沸法处理样品。取30 μg蛋白样品进行蛋白电泳(SDS-PAGE),根据目的蛋白不同的分子量,选取不同浓度的分离胶。在蛋白电泳过程中浓缩胶电压为100 V,分离胶电压为120 V。蛋白电泳完成之后将分离胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,转膜过程中电压为100 V。将NC膜用5%脱脂奶封闭2 h,然后分别加入SKP2多抗(1 ∶1 000)、p27多抗(1 ∶1 000)和β-actin单抗(1 ∶1 000),室温孵育1 h,4 ℃过夜。次日用含0.5% Tween-20的TBST洗3次,5 min/次;再分别加入1 ∶5 000)HRP标记的二抗室温摇床孵育1 h。TBST洗3次,5 min/次,ECL发光检测,胶片显色,分析结果。以β-actin为内参照。

1.5 统计学分析

利用灰度扫面软件ImageJ对Western blot结果进行蛋白定量分析,通过Student’sT检验进行比较,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pBabe-SKP2突变载体的构建与鉴定

利用重组DNA技术以野生型pBabe-SKP2为模板,分别构建了SKP2失活型突变体pBabe-SKP2S72A和组成性活化突变体pBabe-SKP2S72D,并对三者进行了测序比对。野生型载体测序结果见图1,pBabe-SKP2S72A突变型载体测序结果见图2,pBabe-SKP2S72D突变型载体测序结果见图3。

2.2 pBabe-SKP2野生型和突变质粒在HEK293细胞中的表达鉴定

为了进一步验证pBabe-SKP2能否在细胞中正确表达,本研究进行了细胞转染和Western blot实验。结果显示,相对于pBabe阴性对照组,转染过表达载体pBabe-SKP2组、突变载体p-BabeSKP2S72A组和pBabeSKP2S72D组的HEK293细胞中SKP2的蛋白表达水平明显升高(P<0.05,见图4)。

图1 重组质粒pBabe-SKP2测序结果Figure 1 Sequencing result of recombinant plasmidpBabe-SKP2

图2 重组质粒pBabe-SKP2S72A测序结果(下划线为突变碱基)Figure 2 Sequencing result of pBabe-SKP2S72A(mutations were marked with the underscore)

图3 重组质粒pBabe-SKP2S72D测序结果(下划线为突变碱基)Figure 3 Sequencing result of pBabe-SKP2S72D(mutations were marked with the underscore)

1.pBabe;2.pBabe-Skp2;3.pBabe-Skp2S72A;4.pBabe-Skp2S72D与pBabe组比较，*P<0.05图4 Western blot法检测SKP2的表达Figure 4 Detection of SKP2 expression by Western blot

2.3 SKP2野生型和突变型载体在HEK293细胞对P27蛋白水平的影响

为了进一步验证pBabe-SKP2真核表达载体的功能,通过Western blot实验对SKP2下游底物蛋白P27表达进行了检测。结果显示,相对于pBabe阴性对照组,转染野生型SKP2组的P27表达水平显著降低(P<0.05),而转染失活突变载体pBabe-SKP2S72A组的P27水平没有受到抑制(P=0.736 8),转染组成性活化pBabe-SKP2S72D组的P27的蛋白表达水平明显降低(P<0.05,见图5)。以上结果证明pBabe-SKP2S72A和pBabe-SKP2S72D突变表达载体构建成功并可以正确表达并发挥功能,可用于后期实验研究。

1.pBabe;2.pBabe-Skp2;3.pBabe-Skp2S72A;4.pBabe-Skp2S72D与pBabe组比较，*P<0.05图5 Western blot法检测SKP2对P27蛋白水平表达的影响Figure 5 Effect of SKP2 on P27 protein expression levels by Western blot

3 讨论

SKP2是泛素依赖性蛋白水解途径中(ubiquitin-proteasome system,UPS)泛素连接酶E3的组成部分,SKP2定位于5p13,编码的蛋白质由436个氨基酸组成,分子量约47 kDa。SKP2主要通过泛素化(ubiquitin)降解细胞周期相关蛋白如P27等,使其通过泛素-蛋白酶体途径降解,促进细胞周期的转换,已成为癌变过程中不可忽视的重要因子[8-11]。在乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤中,SKP2的表达和活性都增强[12-18]。

SKP2的两个重要的磷酸化位点,分别位于64位和72位的丝氨酸。丝氨酸72位点在M期的磷酸化程度最高。不仅丝氨酸72位的磷酸化诱导P27蛋白的磷酸化降解,此外,SKP2蛋白在丝氨酸72位点的磷酸化在促进细胞的增殖和肿瘤的发生过程中至关重要[19,20]。因此,构建SKP2的72位点丝氨酸的突变载体,对于研究SKP2的功能具有十分重要的意义。

SKP2蛋白有可能成为未来肿瘤治疗的新靶点,它的检测对肿瘤的预防、诊断和预后评估具有重要的参考价值,可作为一种探索癌症及癌前病变发生机制的重要生物学指标。本实验成功构建了SKP2的两个真核突变载体pBabe-SKP2S72A和SKP2S72D,首先通过测序证明载体序列正确,并在蛋白质水平证明SKP2突变载体组的SKP2蛋白表达明显升高。为了进一步研究SKP2的功能,在过表达野生型或突变型SKP2的实验组中,其下游靶基因P27蛋白水平均发生显著变化。以上结果显示,我们成功构建了SKP2的突变载体,为进一步研究SKP2在肿瘤的发生和发展中的作用及其分子机制奠定了一定的实验基础。

[1] Steinman RA, Hoffman B, Iro A,etal. Induction of p21 (WAF-1/CIP1) during differentiation[J]. Oncogene, 1994, 9(11): 3389-3396.

[2] Pfeuty B,David-Pfeuty T, Kaneko K. Underlying principles of cell fate determination during G1 phase of the mammalian cell cycle[J]. Cell Cycle, 2008, 7(20):3246-3257.

[3] Bochis OV, Irimie A, Pichler M,etal. The role of Skp2 and its substrate CDKN1B (p27) in colorectal cancer[J]. J Gastrointestin Liver Dis, 2015,24(2):225-234.

[4] Signoretti S, Di Marcotullio L, Richardson A,etal. Oncogenic role of the ubiquitin ligase subunit Skp2 in human breast cancer[J]. J Clin Invest, 2016,126(11):4387.

[5] Qu X, Shen L, Zheng Y,etal. A signal transduction pathway from TGF-beta1 to SKP2 via Akt1 and c-Myc and its correlation with progression in human melanoma[J]. J Invest Dermatol, 2014, 134(1):159-167.

[6] Gao D, Inuzuka H, Tseng A,etal. Phosphorylation by Akt1 promotes cytoplasmic localization of Skp2 and impairs APCCdh1-mediated Skp2 destruction[J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(4):397-408.

[7] Liu J, Wei XL, Huang WH,etal. Cytoplasmic Skp2 expression is associated with p-Akt1 and predicts poor prognosis in human breast carcinomas[J]. PLoS One, 2012, 7(12):e52675.

[8] Schulman BA, Carrano AC, Jeffrey PD,etal. Insights into SCF ubiquitin ligases from the structure of the Skp1-Skp2 complex[J]. Nature, 2000, 408(6810):381-386.

[9] Zheng N, Schulman BA, Song L,etal. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex[J]. Nature, 2002, 416(6882):703-709.

[10] Hershko DD. Oncogenic properties and prognostic implications of the ubiquitin ligase Skp2 in cancer[J]. Cancer, 2008, 112(7):1415-1424.

[11] Ruan D, He J, Li CF,etal. Skp2 deficiency restricts the progression and stem cell features of castration-resistant prostate cancer by destabilizing Twist[J]. Oncogene, 2017:Epub ahead of print.

[12] Ma XM, Liu Y, Guo JW,etal. Relation of overexpression of S phase kinase-associated protein 2 with reduced expression of p27 and PTEN in human gastric carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(42): 6716-6721.

[13] Bar-On O, Shapira M, Hershko DD. Differential effects of doxorubicin treatment on cell cycle arrest and Skp2 expression in breast cancer cells[J]. Anticancer Drugs,2007,18(10):1113-1121.

[14] Shibahara T, Onishi T, Franco OE,etal. Down-regulation of Skp2 is correlated with p27-associated cell cycle arrest induced by phenylacetate in human prostate cancer cells[J]. Anticancer Res, 2005, 25(3B):1881-1888.

[15] Yokoi S, Yasui K, Mori M,etal. Amplification and overexpression of SKP2 are associated with metastasis of non-small-cell lung cancers to lymph nodes[J]. Am J Pathol, 2004, 165(1):175-180.

[16] Xu J, Zhou W, Yang F,etal. The beta-TrCP-FBXW2-SKP2 axis regulates lung cancer cell growth with FBXW2 acting as a tumour suppressor[J]. Nat Commun, 2017, 8:14002.

[17] Su L, Han D, Wu J,etal. Skp2 regulates non-small cell lung cancer cell growth by Meg3 and miR-3163[J]. Tumour Biol, 2016, 37(3):3925-3931.

[18] Pateras IS, Apostolopoulou K, Koutsami M,etal. Downregulation of the KIP family members p27(KIP1) and p57(KIP2) by SKP2 and the role of methylation in p57(KIP2) inactivation in nonsmall cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2006, 119(11):2546-2556.

[19] Lin HK, Wang G, Chen Z,etal. Phosphorylation-dependent regulation of cytosolic localization and oncogenic function of Skp2 by Akt/PKB[J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(4):420-432.

[20] Wang H, Cui J, Bauzon F,etal. A comparison between Skp2 and FOXO1 for their cytoplasmic localization by Akt1[J]. Cell Cycle, 2010, 9(5):1021-1022.

Construction and biological functional study of SKP2 mutant vector SKP2S72A and SKP2S72D

QU Xuan*,LI Jun,MA Xiaojun,HAN Luochuan,SHI Hailong

(DepartmentofBiology,ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China;*Correspondingauthor,E-mail:quxuan519@163.com)

ObjectiveTo construct the SKP2 mutant vectors SKP2S72A and SKP2S72D, and verify their biological function.MethodsSKP2 mutant sequence was obtained with one-step PCR assay, and then the fragments were inserted into pBabe vector by digestion and DNA ligation. The constructed plasmid was transformed into DH5α.The positive clones were selected and sequenced, and then transfected into HEK293 cells to determine the expression and effects on P27 expression.ResultsThe sequences of the SKP2S72A and SKP2S72D were consistent with that of the SKP2 mutant sequence. The SKP2S72A and SKP2S72D vectors were purified for gene transfection. The constructs successfully expressed in mammal cells and affected the P27 expression.ConclusionSKP2 mutant constructs are successfully obtained.The results provide the basis for the further studies of the biological function of SKP2.

SKP2; mutant vector; overexpression plasmid

国家自然科学基金青年基金资助项目(81502370)；陕西省高校科协青年人才托举计划项目(20170407)

曲璇,女,1983-05生,博士,讲师

2017-05-16

Q782

A

1007-6611(2017)08-0813-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.012