芒果苷联合麻黄碱治疗过敏性哮喘的作用研究

2017-08-29运晨霞兰太进1邓家刚郭宏伟

中国药理学通报 2017年9期

运晨霞，杜军，兰太进1,，邓家刚，郭宏伟

(1. 广西中医药大学基础医学院，广西南宁 530200；2. 广西医科大学研究生院，广西南宁 530021；3. 广西中药药效筛选重点实验室，广西南宁 530200；4. 长寿与老年相关疾病教育部重点实验室，广西南宁 530021；5. 广西医科大学药学院，广西南宁 530021)

运晨霞1,2，杜军3，兰太进1,3，邓家刚3，郭宏伟4,5

目的探讨芒果苷联合麻黄碱治疗过敏性哮喘的作用及分子机制。方法运用OVA建立过敏性哮喘小鼠模型，观察小鼠哮喘发作时表现及给药1 h后小鼠自主活动变化；观察外周血白细胞分类并计数；HE染色观察肺组织炎症细胞浸润；ELISA法检测小鼠血清中OVA-sIgE和cAMP的含量；RT-PCR法检测小鼠肺组织中IFN-γ、IL-4、IL-5的mRNA表达。结果联合给药组和芒果苷组可明显减少由麻黄碱引起的小鼠自主活动力增强表现；各治疗组均可明显减轻小鼠哮喘发作表现，改善肺组织的病理学改变，减轻气道炎症，联合给药组效果优于芒果苷组；各治疗组均能明显减少全血中白细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS)比例；降低血清中OVA-sIgE含量，联合给药组作用优于芒果苷组；麻黄碱组和联合给药组可升高血清中cAMP含量；联合给药组可降低肺组织中Th2型细胞因子IL-4和IL-5 mRNA表达水平，同时上调Th1型细胞因子IFN-γ mRNA表达水平。结论联合用药组平喘效果优于芒果苷组，并能减轻单用麻黄碱所引起的不良反应。其作用机制可能与调节Th1/Th2型细胞因子的失衡及升高cAMP含量相关。

哮喘；小鼠；芒果苷；麻黄碱；联合用药；分子机制

芒果苷(mangiferin)是芒果叶中的主要活性成分，具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、保肝、免疫调节等多种药理活性[1-2]。课题组前期研究发现，芒果苷可抑制哮喘小鼠气道炎症，其平喘机制主要与扭转Th1/Th2失衡有关[3]。麻黄碱(ephedrine)是中药麻黄的主要成分，对哮喘有明显的治疗作用，但长期大量使用可引起心悸、多汗、眩晕、震颤、烦躁焦虑、失眠等不良反应[4]。因此，在临床用药中，麻黄碱往往与其他药物联合应用，如甘草酸、黄芩苷以及桂枝、桔梗、桑白皮、百部提取物等，不仅提高了平喘的效果，而且可减少麻黄碱的副作用[5]。芒果苷与麻黄碱均可以治疗哮喘，但作用机制不同，在前期研究中我们发现单一使用芒果苷很难达到很好的治疗效果。因此，在本研究中我们将芒果苷与麻黄碱联合应用，观察其是否能够发挥多机制的联合治疗作用，提高芒果苷的平喘效果，同时降低单用麻黄碱所引起的不良反应，为芒果苷与麻黄碱联合用药治疗过敏性哮喘提供前期理论基础。

1 材料

1.1实验动物SPF级 ♀ BALB/c小鼠，4～5周龄，体质量(18±2)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(湘)2009-0004。

1.2药物与试剂芒果苷，由广西中药药效筛选重点实验室提供，纯度达98.39%以上；盐酸麻黄碱注射液，购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司，规格：30 g·L-1，批号：110902-2；地塞米松，购自浙江仙琚制药股份有限公司，规格：0.75 mg/片，批号：120252。鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)(grade Ⅴ)、Al(OH)3凝胶(13 g·L-1)，购自Sigma公司；Anti-OVA-sIgE ELISA Kit ，购自美国Cayman Chemical公司；环化腺核苷一磷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)定量分析试剂盒，购自美国HCB公司；动物组织总RNA提取试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMix，购自北京天根生化科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.3仪器5810R型低温超速离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)；PARI BOY N(085G1005)型空气压缩雾化器(470 mg·min-1)(德国百瑞公司)； Elx800型全自动酶标仪(奥地利DIALAB公司)；YLS 多功能小鼠自主活动记录仪(山东省医学科学院设备供应维修站)；UV-1700紫外分光光度计(日本岛津公司)；DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；Carestream 212 PRO 型凝胶成像系统(美国伯乐公司)。

2 方法

2.1动物分组♀ BALB/c小鼠60只，随机分为6组，分别为正常组(normal)、模型组(model)、地塞米松阳性对照组(dexamethasone, 1.25 mg·kg-1)、芒果苷组(mangiferin, 200 mg·kg-1)、麻黄碱组(ephedrine, 100 mg·kg-1)、芒果苷(200 mg·kg-1)与麻黄碱(100 mg·kg-1)联合组(combination)，每组10只。

2.2模型制备与给药

2.2.1致敏于实验d 1(实验开始当天)、d 8、d 15分别致敏，共3次。除正常组外，其余各组小鼠腹腔注射OVA致敏液(含OVA 20 μg+氢氧化铝佐剂150 μL)，每只0.2 mL。正常组用PBS液代替OVA致敏液，方法同其余各组。

2.2.2激发于实验d 25～29激发，连续5 d。除正常组外，其余各组小鼠置于自制的密闭玻璃容器中(25 cm×30 cm×40 cm)，以1% OVA进行雾化吸入激发(雾化颗粒平均直径为3.7 μm)，每次20 min，1次/日，以激发哮喘。正常组采用PBS液代替OVA激发，方法同其余各组。

2.2.3药物干预各组于实验d 16～29灌胃给药，药物剂量的选择参照预实验结果和前期研究[3]，灌胃体积为20 mL·kg-1，1次/日，连续14 d，联合用药组隔天给药。正常组和模型组给予等量生理盐水。

2.3标本采集各组于末次激发24 h后，眼球取血，静置后，4℃离心(3 000 r·min-1×10 min)，取血清，- 80℃保存备用。取血后，小鼠取仰卧位固定，沿腹中线剖至口及胸膈以下，取右肺中叶，放入去酶EP管中。再取左肺，放入装有4%多聚甲醛的EP管中。

2.4指标观察

2.4.1给药后小鼠自主活动力的变化各组小鼠分别于给药前及给药后1 h放入多功能小鼠自主活动记录仪，测其自主活动力，主要记录小鼠在一定区域、一定时间内的自主活动量。初步判断药物对小鼠的兴奋或抑制情况。将小鼠依次单只放入仪器的分隔中，先平衡5 min，使其适应环境，再通过光敏监控小鼠在2 h内的活动次数，连续观察14 d。

2.4.2芒果苷对小鼠哮喘发作症状的影响激发时，观察小鼠是否有头面部瘙痒、喷嚏或呛咳、呼吸急促、躁动不安、紫绀、腹式呼吸、俯卧不动、大小便失禁、毛色等变化。并对小鼠哮喘的发作程度进行评分。

2.4.3全血中白细胞计数及分类从抗凝管中取小鼠全血0.02 mL于血细胞计数板，加入0.38 mL红细胞稀释液，测定白细胞总数。再取5 μL做细胞涂片，瑞氏-姬姆萨染色，计数300个细胞作细胞分类计数。

2.4.4小鼠肺组织病理观察 HE染色，光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围EOS浸润情况，根据 Underwood 等[6]提出的标准进行评分。

2.4.5血清中OVA-sIgE和cAMP的含量测定采用ELISA法检测血清中OVA-sIgE和cAMP的含量，操作按照试剂盒说明书进行。

2.4.6RT-PCR法检测小鼠肺组织中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4、IL-5的mRNA表达水平小鼠肺组织总RNA提取及鉴定，逆转录合成cDNA(按照试剂盒说明书进行)，根据引物(Tab 1)进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，61℃退火30 s，75℃延伸 60 s，35个循环后，72℃反应5 min。其中，白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)退火温度为64℃，白细胞介素5(interleukin 5, IL-5)退火温度为62℃，γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)为59℃。PCR产物置1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像分析系统中观察电泳结果，标记并保存图像。

3 结果

3.1给药后小鼠自主活动力的变化由Fig 1A可看出，与正常组相比，麻黄碱组在给药1 h后小鼠的自主活动力明显增强(P<0.01)；与麻黄碱组相比，芒果苷组和联合用药组小鼠自主活动力均有所下降(P<0.01)。

3.2激发阶段小鼠哮喘发作表现实验前各组动物的外观、行为及对刺激的反应、活动、体重均无明显差异。致敏阶段，各组小鼠的腹腔注射部位无红肿、溃烂。激发时，正常组小鼠呼吸相对平稳，偶尔出现轻微的抓耳挠腮、喷嚏或呛咳现象，毛色和二便正常。与正常组相比，模型组小鼠哮喘发作症状明显(P<0.05,P<0.01)，出现烦躁不安、抓耳挠腮、喷嚏或呛咳、呼吸急促，收腹明显，并随着激发次数的增加不断加重，口鼻、耳朵及脚趾部紫绀明显，粪便增多稀溏，部分小鼠激发时弓背或俯卧不动，反应迟钝，毛色较差且无光泽。各给药组小鼠亦出现抓耳挠腮、喷嚏或呛咳、呼吸急促，呼吸幅度加深等症状，但与模型组相比症状明显减轻(P<0.01)。联合给药组的哮喘发作症状明显轻于芒果苷组(P<0.05)。见Fig 1B。

3.3哮喘小鼠肺组织病理学改变HE染色结果显示，模型组支气管壁增厚，气道黏膜皱缩增多，上皮细胞肿胀脱落。肺泡壁明显增厚充血、水肿及炎症细胞浸润。血管和支气管周围组织有大量以EOS为主的炎症细胞浸润。与模型组比较，各治疗组肺组织上述病变均有减轻，肺组织结构尚好，其中联合给药组作用效果尤为明显。与芒果苷组相比，联合组肺部炎性病变改善明显(P<0.05)。见Fig 1C、1D。

3.4芒果苷联合麻黄碱对哮喘小鼠全血中白细胞总数及分类的影响由Fig 2A、2B可以看出，与正常组相比，模型组小鼠全血中白细胞总数和EOS比例均升高(P<0.01)。与模型组相比，各治疗组白细胞总数和EOS比例均明显降低(P<0.05，P<0.01)。

3.5芒果苷联合麻黄碱对哮喘小鼠血清中OVA-sIgE和cAMP含量的影响与模型组相比，各治疗组均明显减少了小鼠血清中OVA-sIgE的含量(P<0.01)；联合组与芒果苷组相比，差异有显著性(P<0.05)。与模型组相比，麻黄碱组和联合给药组小鼠血清中cAMP含量均有升高(P<0.05，P<0.01)。见Fig 2C、2D。

3.6芒果苷联合麻黄碱对哮喘小鼠肺组织中Th1/Th2型细胞因子mRNA表达影响从Fig 3可以看出，模型组IL-4和IL-5 mRNA表达水平与正常组相比明显增高(P<0.05，P<0.01)，IFN-γ mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较，联合给药组可降低肺组织中Th2型细胞因子IL-4和IL-5 mRNA表达水平(P<0.05，P<0.01)，同时上调Th1型细胞因子IFN-γ mRNA表达水平(P<0.01)。同模型组相比，芒果苷组可下调IL-5、上调IFN-γ的mRNA表达水平(P<0.05，P<0.01)。麻黄碱组可降低IL-4和IL-5的 mRNA水平(P<0.01)。

Tab 1 Oligonucleotide sequences of semi-quantitative RT-PCR

Fig 1 Locomotor activities, OVA-induced asthmatic symptom and lung histological changes in experimental mice(±s, n=8)

4 讨论

现代医学表明，哮喘的发生是一个涉及体内多种细胞和炎症因子参与的过程[7]。从抗原初次进入机体，机体Th细胞亚群失衡，导致B细胞活化分化成浆细胞，产生IgE类型的抗体的致敏阶段；到抗原再次进入机体，肥大细胞活化释放炎症介质激发阶段；以及炎症介质作用到靶器官的效应阶段。每个阶段的干预都可以阻止哮喘的发生，所以治疗药物有多种，作用在哮喘发生的不同阶段。芒果苷与麻黄碱均可以治疗哮喘，但作用机制不同。

本课题组前期研究结果表明，芒果苷主要是通过抑制患者体内失衡的Th1/Th2细胞亚群，调控炎症因子的释放，达到平喘的效应[3]。而麻黄碱可直接兴奋支气管平滑肌β受体，激活肥大细胞内的腺苷酸环化酶，使cAMP水平升高，平滑肌松弛，哮喘平息[8]。但长期大量使用可引起心悸、多汗、眩晕、震颤、烦躁焦虑、失眠等不良反应。本实验将二者联合应用，既想调节患者机体失衡的免疫系统，又想快速平息支气管平滑肌的痉挛达到平喘效果，标本兼治，发挥多机制的联合治疗作用。在给药方法上，二者联合应用时或者剂量减半，或者隔天给药。我们在前期预实验中发现，隔天给药组的效果优于剂量减半组，且不良反应较小，因此，在本研究中选择了隔天给药的方式。实验结果也表明，相对于芒果苷单用组，联合给药组在减轻小鼠哮喘发作表现、改善肺组织的病理学改变、减轻气道炎症等方面显示出一定优势，同时联合用药可降低由麻黄碱所致小鼠亢奋、活动次数增加等不良表现。在作用机制方面，联合给药组可降低小鼠肺组织中Th2型细胞因子IL-4和IL-5 mRNA表达水平，同时上调Th1型细胞因子IFN-γ mRNA表达水平。因此，二者联合用药的分子机制可能是通过调节Th1/Th2型细胞因子的失衡，从而降低哮喘小鼠体内EOS浸润及OVA-sIgE含量。同时，升高cAMP含量，缓解支气管平滑肌的痉挛，减轻气道炎症。

Fig 2 OVA-induced total leukocytes, eosinophil infiltration, and levels of IgE and cAMP in serum(±s, n=8)

Fig 3 Effect on mRNA levels of Th1 and Th2cytokines in the lung tissues(±s, n=6)

(致谢: 本实验主要在广西中药药效筛选重点实验室和长寿与老年相关疾病教育部重点实验室完成, 在此对实验室的各位老师及同学的帮助致以衷心的感谢！)

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Mangiferinandephedrinecombinedtreatmentinasthmaticmousemodel

YUN Chen-xia1,2, DU Jun3, LAN Tai-jin1,3, DENG Jia-gang3, GUO Hong-wei4,5
(1.SchoolofBasicMedicalScience,GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530200,China; 2.GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 3.GuangxiKeyLabofPharmacodynamicStudiesofTraditionalChineseMedicine,Nanning530200,China; 4.KeyLabofLongevityandAging-relatedDisease,ChineseMinistryofEducation,Nanning530021,China; 5.CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

AimTo investigate the combined effect of mangiferin and ephedrine as well as explore its underlying mechanism in mouse model of allergic asthma.MethodsThe mouse model of asthma was sensitized and challenged with ovalbumin(OVA). The behaviors of mice during the challenging period were observed. Continuous autonomic activities of mice after 1 h of drug treatment were monitored with the autonomic activity recorder for 14 days. The total and differential cells in peripheral blood were counted. Histological study of lung sections on airway inflammation was carried out with haematoxylin and eosin(HE) staining. The levels of ovalbumin-specific immunoglobulin E(OVA-sIgE) and(Cyclic Adenosine monophosphate) cAMP in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). The mRNA expression of cytokines mainly produced by Th1/Th2 lymphocytes such as IFN-γ and IL-4, IL-5 were semi-quantitatively analyzed with reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsCombination treatment and mangiferin could reduce the aberrantly autonomic activity caused by ephedrine in mice. Compared with the model group, asthmatic symptoms in all treatment groups could be significantly relieved, the pathological changes of lung tissue were improved and airway inflammation was reduced. The effect of combined treatment was better than that of mangiferin treatment alone. Compared with the model group, the total number of white blood cells(WBC) and the eosinophils(EOS) ratio in peripheral blood in all treatment groups decreased, the level of OVA-sIgE declined and the level of cAMP increased in serum. Combination treatment could lower mRNA expressions of IL-4 and IL-5 from Th2 lymphocytes and increase the mRNA expressions of IFN-γ released by Th1 lymphocytes.ConclusionsThe effect of combined therapy of mangiferin and ephedrine is better than that of mangiferin treated alone, meanwhile it can reduce the side effects caused by ephedrine. The underlying mechanism is mainly associated with attenuating Th1/Th2 cytokine imbalance and increasing the level of cAMP.

asthma; mouse; mangiferin; ephedrine; drug combination; molecular mechanism

时间：2017-8-20 16:47 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.048.html

2017-06-02,

2017-07-03

中国博士后科学基金资助项目(No 2015M582483)；广西省自然科学基金资助项目(No 2015GXNSFAA139105)；广西省科学研究与技术开发计划项目(No桂科攻1598013-8)；广西省高校科学技术研究项目(No KY2015YB057)

运晨霞(1977-)，女，博士生，副教授，研究方向：中药免疫药理机制，E-mail: 305358474@qq.com；郭宏伟(1980-)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药抗肿瘤及免疫药理学，通讯作者，E-mail: hongweiguo@hotmail.com；邓家刚(1953-)，男，教授，博士生导师，研究方向：中药理论及药效筛选、新药开发，通讯作者，E-mail: dengjg@ tom. com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.024

：1001-1978(2017)09-1314-06

R-332；R284.1；R322.35；R392.12；R562.250.5