XpertMTB/RIF试验快速诊断结核病的研究进展

付沛文(FU Pei-wen)，李世宝(LI Shi-bao),2，李洪春(LI Hong-chun),2，顾 兵(GU Bing),2

(1 徐州医科大学医学技术学院, 江苏 徐州 221004; 2 徐州医科大学附属医院, 江苏 徐州 221002)

·综述·

XpertMTB/RIF试验快速诊断结核病的研究进展

付沛文(FU Pei-wen)1，李世宝(LI Shi-bao)1,2，李洪春(LI Hong-chun)1,2，顾 兵(GU Bing)1,2

(1 徐州医科大学医学技术学院, 江苏 徐州 221004; 2 徐州医科大学附属医院, 江苏 徐州 221002)

结核病; Xpert MTB/RIF试验; 诊断效能

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的慢性传染病，仍然是全世界公共卫生面临的重大威胁。据世界卫生组织统计[1-2]，我国2014年的新发肺结核人数位居全球第三位，是22个全球结核病高负担国家之一。目前肺结核的诊断主要依靠痰涂片抗酸染色，但由于痰涂片对标本的含菌量要求高，导致其诊断结核病的敏感度较低。诊断结核病的金标准是MTB培养[3]，由于MTB生长缓慢的习性，导致培养所需时间较长(2～6周)，仅用MTB培养诊断结核病可能延误治疗。耐多药结核病的传统诊断方法是药物敏感试验[4]，该方法有对实验室要求高及耗时长的缺点。因此，寻求快速诊断结核病和耐多药结核病的方法成为控制结核病的重点。近些年涌现出许多基于分子生物学或免疫学的方法，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB /RIF)就是其中最有应用前景的方法之一。本文就Xpert MTB /RIF的发展、应用现状以及对特殊人群的诊断价值进行综述。

1 Xpert MTB /RIF检测方法的发展

Xpert MTB /RIF试验以半巢式实时荧光定量PCR技术为基础，rpoB基因为靶基因，系统自动运行并检测标本中是否含有结核分枝杆菌，以及利福平是否耐药，全程约2 h。1998年，Piatek等[5]首先提出以分子信标技术为基础，以rpoB基因为靶基因对结核分枝杆菌进行检测的试验模型，随后有多位研究者将分子信标技术应用于耐药结核菌株的检测[6-7]。全自动快速分子病原学诊断检测系统Gene Xpert平台由美国国防部资助研发，2009年美国Cepheid公司在Gene Xpert PCR平台基础上成功研发出一种应用于结核病诊断领域的新技术——Xpert MTB/RIF技术，包括Gene Xpert PCR平台和Xpert MTB/RIF诊断试剂盒。2010年12月，世界卫生组织(WHO)首次向国际社会推荐将Xpert MTB/RIF用于结核病和利福平耐药快速检测，并组织专家组对该技术检测的准确性进行综述性分析，于2011年初推出关于Xpert MTB/RIF应用的政策性指南[8]，对其进行重点推广。

1.1 测定原理 Xpert MTB/RIF试验以半巢式实时定量PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，设计出5个相互重叠的分子探针(分别以探针A～E命名)选择性覆盖rpoB基因的81 bp核心区，同时根据球芽孢杆菌的基因组设计1条对照探针，通过这条探针的荧光显示结果对标本中的结核分枝杆菌及对利福平的耐药情况进行检测，具体理论基础如下。

1.1.1 rpoB基因在同一菌种中高度保守 分枝杆菌的rpoB基因为分枝杆菌依赖DNA的RNA聚合酶β亚单位的编码基因，rpoB基因同时具有保守序列和可变序列，具有显著的种间相似度和种内相似度高的特点，利用rpoB基因的保守序列和可变序列，可以对分枝杆菌进行菌种鉴定。

1.1.2 MTB对利福平的耐药机制由rpoB基因的点突变造成 利福平的作用机制是与结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶中的β亚基结合，干扰转录的开始和RNA的延长而起到抗菌作用，rpoB基因的突变可导致利福平无法与β亚基结合而失效。此外，由于大部分利福平耐药菌株同时对异烟肼耐药，故利福平耐药情况在一定程度上可作为耐多药结核病的监测指标[9]。

1.2 试验方法 将不同标本按相应预处理方法处理后，取2 mL所得混合液转移至一次性多室塑料反应盒中。样品自动洗涤和过滤，自动超声破碎样品，释放核酸，DNA与PCR试剂混合，半巢式荧光定量PCR扩增和检测，打印结果。不同类型临床标本预处理方法[10]，见表1。

表1 Xpert MTB/RIF试验中不同临床标本的预处理方法

1.3 结果判读 结果判读依照探针的循环阈值(Ct值)，当内对照探针(即芽孢杆菌内对照)的Ct值≤38时为阳性，反之则为无效，提示标本提取不合格或含有PCR抑制物。MTB阳性的诊断标准为5个探针中至少2个探针Ct值≤38，并可进一步按照Ct值对标本中的MTB进行半定量分析，Ct值<16为高荷菌量，16～22为中等荷菌量，22～28为低荷菌量，>28为极低荷菌量。检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期Ct值与晚期Ct值之差，即△Ct值。系统设置的结果判断标准为：△Ct>3.5提示对利福平耐药，△Ct≤3.5提示对利福平敏感。由于终止循环数为38个循环，因此，当早期探针Ct值>34.5或晚期探针>38时，利福平耐药结果不确定。

2 MTB/RIF试验对不同临床标本的诊断效能

研究表明，Xpert MTB/RIF试验对肺结核的诊断价值已经逐步得到证实[11-12]，其中痰标本敏感度最高可达97.50%，特异度在95.00%～99.00%；但对肺外结核诊断研究尚不一致，敏感度欠佳，但是具有较高的特异度，即在确诊肺外结核方面具有较高的价值。国内外Xpert MTB/RIF试验与涂片显微镜检查针对不同类型临床标本检测效能(以细菌培养结果为金标准)[13-22]，见表2。

表2 不同类型临床标本Xpert MTB/RIF试验与涂片显微镜检查的敏感性与特异性(%)

3 Xpert MTB/RIF试验在特殊人群中结核病诊断价值

2015年，世界范围内估计有1 040万新发结核病病例，其中成人患者中男性590万(56.73%)，女性350万(33.65%)；儿童100万(9.62%)。新发病例中有120万(11.54%)人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者[2]。国内外研究[23-25]证实，Xpert MTB/RIF试验在成年人及未感染HIV的患者中有较高的敏感性和特异性，而在儿童结核病以及结核合并HIV感染者中的应用价值尚在研究阶段。

3.1 Xpert MTB/RIF试验在儿童结核病诊断中的应用 儿童是结核菌的主要易感者，少数感染严重的儿童，会发生急性血行播散型结核病和结核性脑膜炎等严重疾病，危及儿童健康和生命。每年约有7.4万例HIV阴性患儿死于结核病[26]。早期发现和早期治疗儿童原发型肺结核对进一步降低结核病病死率有重要意义。结核病患儿细菌载量低于成人患者，病灶部位常伴有明显炎性渗出，排菌量低，且婴幼儿排痰困难，常将痰液咽下，涂片镜检在儿童标本中的阳性率不足15%[27]。Singh等[28]报道了2009—2012年Xpert MTB/RIF试验在印度地区儿童结核病中的应用情况，以培养为金标准，胃液标本敏感性和特异性分别为67.5%和89.6%，痰标本为70.0%和94.3%。国内张爱梅等[29]研究中胃液标本和痰标本的敏感性分别为33.3%和57.1%，低于印度地区，但两种标本特异性较高，均为100%。Tortoli等[30]通过对494份儿童非呼吸道标本(包括组织活检、脓液、胃肠道抽吸物、尿和脑脊液)的检测用于诊断肺外结核，发现其敏感性达到86.9%，结果略高于成人。Xpert MTB/RIF试验对儿童结核病的诊断价值尚需更多的研究证实并推广。

3.2 Xpert MTB/RIF试验在筛查HIV感染结核病患者中的应用 HIV感染者与艾滋病(AIDS)患者由于处于免疫妥协状态，多表现为肺外结核和涂阴肺结核，目前诊断潜伏性MTB感染的检测手段敏感度欠佳，漏诊率较高。MTB感染导致机体免疫应答反应以细胞免疫为主，但对于HIV感染者与AIDS患者来说，不同的免疫缺陷程度影响着潜伏性感染检测手段的应答反应。研究[31]表明在高MTB感染的流行区域，PPD试验阳性的发生率在HIV感染者与非HIV感染者人群之间有明显差异，只有当CD4+淋巴细胞计数>500个/μL时，两组发生率是相似的。研究显示CD4+淋巴细胞计数对PPD试验和T-SPOT这两种检测方法的检测结果均起重要作用，其阳性率与CD4+淋巴细胞计数呈正比，且认为，相较于PPD试验而言，T-SPOT受CD4+淋巴细胞计数的影响更小[32]。Carriquiry等[33]对131例临床高度怀疑结核病的HIV感染者进行Xpert MTB/RIF试验检测，并与改良罗氏培养和液体培养方法比较，结果显示，Xpert MTB/RIF试验的敏感性高达97.8%，特异性为97.7%；阳性预测值为95.7%，阴性预测值为98.8%。一项由多国共同参与的结核病防治项目数据显示[34]，Xpert MTB/RIF试验在HIV感染者中的敏感性(82.4%)与非HIV感染者(90.7%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在同时进行的痰涂片显微镜检测中，HIV感染者的敏感性为44.6%；非HIV感染者敏感性为68.6%。因此，WHO建议，Xpert MTB/RIF试验可作为HIV感染者及AIDS患者结核病筛查的首选方法。

4 Xpert MTB/RIF试验用于疗效监测的新进展

2013年，Friedrich等[35]招募221例MTB涂片阳性患者接受结核抗菌药物治疗，并在治疗开始的第0～8周每周获取合格痰标本，利用Xpert MTB / RIF测定MTR特异性DNA测序，随后在第12、17、22、26周做相同操作，并将结果与镜下涂片和细菌培养进行比较，结果显示Xpert MTB/RIF试验相比于以上两种方法，有较高的灵敏度(95%CI：95.8%～97.9%)和较低的特异度(95%CI：45.0%～52.2%)。作者认为Xpert MTB/RIF技术无法识别细菌存活状态，在结核疗效监测过程中假阳性率较高，特异度较低，因此，不宜用于MTB治疗过程的疗效监测。

目前有新的研究[36]认为，Friedrich等将Xpert结果仅以“DNA检出”或“DNA未检出”作为二元指标进行疗效监测存在一定的缺陷。Xpert能揭示循环阈值(Ct)中的定量输出，进而可纵向动态检测痰液中杆菌的载荷量。结果显示，采用非线性混合效应模型来表明纵向Ct数据与利福喷丁暴露量之间的关系(浓度-时间曲线下面积[AUC])，利福喷丁药物暴露量每增加100 mcg*h/mL，Ct斜率约上升0.11Ct /周(95%CI：0.05-0.17)，利福喷丁暴露量(未分配剂量)与Ct变化率相关(P= 0.02)；此外，研究还发现利福喷丁用药量增加与Xpert Ct变化率加快(表明结核分枝杆菌DNA清除加快)有关[36]。目前临床上无统一有效的肺结核病疗效评价标准，此类研究为Xpert MTB/RIF试验用于结核病疗效监测提供了新思路。

5 展望

目前，世界上许多国家已经开展了Xpert MTB/RIF试验。该方法具有高度敏感性和特异性、快速简单、交叉污染少、能同时检测利福平耐药菌株等优点，使之有望在全球范围内得到广泛应用。但是，Xpert MTB/RIF试验检测成本较高；标本中一些非结核分枝杆菌的耐药基因与MTB耐药基因存在一定同源性，使得检测利福平耐药时可出现假阳性结果；且中国大部分地区以异烟肼耐药为主，而该方法不能直接检测MTB异烟肼耐药，只能在一定程度上作为耐多药结核病的监测指标。但其有助于临床上早期快速诊断结核病，更早撤除阴性患者的空气传播隔离，快速识别真正需要隔离的患者，医院可以锁定目标、集中资源，最有效地控制感染。

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(本文编辑：陈玉华)

AdvancesinrapiddiagnosisoftuberculosisbyXpertMTB/RIFtest

(1 College of Medical Technology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, China; 2 Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, China)

2017-04-20

江苏省“教科强卫”医学重点人才项目(ZDRCA2016053)

付沛文(1995-)，女(汉族)，江苏省淮安市人，医学生，主要从事细菌病原体感染研究。

顾兵 E-mail:gb20031129@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.08.022

R521

A

1671-9638(2017)08-0779-05