患者及相关环境分离CRKP的耐药谱与同源性

杨竹兰，张 震，刘智勇，吴 昊，张 波

(1 第三军医大学附属西南医院, 重庆 400038； 2 重庆市人民医院，重庆 400014)

·论著·

患者及相关环境分离CRKP的耐药谱与同源性

杨竹兰1，张 震2，刘智勇1，吴 昊1，张 波1

(1 第三军医大学附属西南医院, 重庆 400038； 2 重庆市人民医院，重庆 400014)

目的了解某医疗机构耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)感染患者临床分离株与环境分离株的同源性。方法收集该院1例患者分离的CRKP与该患者周围环境中检出的4例肺炎克雷伯菌，测定5株菌对临床上常用抗菌药物的敏感性，利用改良Hodge试验和CIM(Carbapenem Inactivation Method)试验检测5株菌产碳青霉烯酶情况，采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对其进行同源性分析。结果药敏试验结果显示，5株肺炎克雷伯菌(1株来自患者，4株来自于患者所在的病房环境，分离自护工手、溶液瓶口、升降扶手、床栏杆)除对头霉素类、氨基糖苷类抗生素的药敏结果不一致外，对其他各类抗菌药物均表现为耐药。改良Hodge试验和CIM试验证实5株菌均产碳青霉烯酶；PFGE结果显示，病房溶液瓶口、床栏杆、病床升降扶手同患者标本分离的CRKP电泳图谱一致，为同一菌株，而护工手同患者标本分离的CRKP电泳图谱有2条条带的差异，其菌株间有相近的关系。结论患者及其周围环境检出同一种CRKP，应严格执行医院感染控制制度，隔离感染患者，加强环境的清洁与消毒，避免医院感染暴发。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶类抗生素； 脉冲场凝胶电泳； 同源性分析

[Chin J Infect Control，2017，16(8)：693-697]

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, K.pn)是医院和社区获得性感染的重要肠杆菌科病原菌，广泛分布于自然界，存在于土壤和水中，人和动物肠道内更常见。碳青霉烯类抗生素是目前治疗肠杆菌科细菌，尤其是产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)和AmpC酶等多重耐药菌引起的严重感染最有效的抗菌药物之一[1]。近年来，随着此类抗生素的广泛应用，临床逐渐出现了耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌，特别是耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的报道逐年增多，涉及的国家和区域越来越广，所引起的医疗机构相关性感染(healthcare-associated infection，HAI)暴发流行逐年递增，给临床抗该菌感染治疗和医疗机构相关性感染控制带来极大的挑战[2-3]。目前，脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)仍然是病原菌流行病学调查和分子分型的金标准[4]，通过分子分型确定菌株间流行病学相关性，对预防和监测肺炎克雷伯菌引起的医疗机构相关性感染具有积极作用。本研究采用PFGE技术，对医疗机构相关性感染患者临床分离株与该患者所住病房环境中分离的肺炎克雷伯进行同源性分析，探讨患者病原菌与其周围环境分离病原菌的关系，追踪医院感染来源，明确传播途径，为减少医院感染的发生提供理论依据，为其他医疗机构医院感染管理科工作人员控制医院感染提供参考案例。

1 对象与方法

1.1 菌株来源 患者标本分离的CRKP来源于本院检验科微生物室，环境来源的4株CRKP来源于本院医院感染管理科。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706，均购于中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与试剂 VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统及革兰阴性杆菌鉴定卡、革兰阴性杆菌药敏卡购自于法国Bio Merieux公司,脉冲场凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司,溶菌酶购自Sigma公司,蛋白酶K购自Roche公司,ApaⅠ限制性内切酶购自TOYOBO公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 本院医院感染管理科通过实时监控系统及检验科微生物检验报告得知，某科室1例患者多次检出CRKP。为预防和控制CRKP医院感染暴发，医院感染管理科于该患者连续3次分离CRKP后开展医院感染调查,对患者周边环境进行了工作状态下的微生物采样(此时距该患者第一次分离CRKP仅一周时间)，共采样17份标本，采样后微生物培养严格参照《医疗机构消毒技术规范》(WS/T 367-2012)[5]及《全国临床检验操作规程》[6]进行。

1.3.2 菌株鉴定和药敏试验 所有菌株均由VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定及药敏试验，药敏判断标准及质控按照2016年版美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准[7]执行。

1.3.3 改良Hodge试验 根据2016年版CLSI推荐，将0.5麦氏单位的大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922菌液稀释10倍后均匀涂布在MH平皿上，中间贴上10 μg/片厄他培南的纸片，将受试菌株以厄他培南纸片为起点，沿离心方向划线，35℃培养过夜，抑菌圈内呈现矢状者为阳性。以肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC BAA 1705为阳性对照，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706为阴性对照。

1.3.4 CIM(carbapenem inactivation method )试验 参考文献[8]，用10 μL接种环刮取要检测细菌的菌落至满环,加入400 μL的蒸馏水中,混匀后放入含量为10 μg的美罗培南药敏纸片，35℃温育至少2 h，在MH药敏平皿上均匀涂布0.5 麦氏单位的大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922，将温育好的美罗培南药敏纸片贴到平皿板上，35℃温育至少6 h，观察结果。如果药敏纸片周围无抑菌圈，则为产碳青霉烯酶，如果药敏纸片周围有抑菌圈，则为阴性。

1.3.5 PFGE 操作步骤参考文献[9-10]描述的方法并略加改进。菌种复活后，挑取新鲜单个菌落用3 mL CSB溶液制备成约4.0 麦氏单位的菌悬液，取200 μL菌悬液于50℃水浴中与1 g/dL低熔点琼脂糖凝胶等体积混合,静置制成凝胶块。凝固后将凝胶块投入到2 mL含有200 μL溶菌酶(20 mg/mL)的CLB溶液中，37℃ 120 r/min干热振荡过夜，吸去CLB溶液，加入含20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的2 mL CLB溶液中55℃ 120 r/min干热振荡过夜，吸去CLB溶液，用50℃ TE溶液洗胶5次，每次50℃,120 r/min 15 min。最后将胶块置于TE溶液中保存于4℃备用。切下2～3 mm大小胶块，浸入150 μL酶切体系中(其中含XbaⅠ酶30 U)，37℃水浴中酶切过夜。电泳参数为6 V/cm，脉冲时间5～20 s，14℃，120度夹角，电泳时间15 h。电泳结束后，将凝胶取出，用GeneGreen液染色30 min，去离子水脱色，凝胶成像系统观察并拍照。

1.4 结果判定 参考《实用临床微生物学检验与图谱》[11]及文献[12]：PFGE图谱一致说明为相同菌株,1～3条带有差异说明菌株间有相近关系，且只有单基因的改变；4～6条带有差异说明菌株间可能有相近关系，表示有两个独立基因的差异；如果菌株间有6条或更多条带差异，说明有3个或更多基因变化，被视为无相关性。

2 结果

2.1 临床资料 患者男性，74岁，因左侧顶枕叶脑出血入院，入院前2年有过两次开颅手术史，术后生活基本能自理。本次入院后第5天出现低热，胸片提示肺部感染，行气管插管切开术，同时送检合格痰培养，检出鲍曼不动杆菌。之后每隔2 d送检1次痰培养，第14天痰培养检出CRKP(菌株缩写：K.pn 1)。

2.2 患者病房环境微生物采样结果 医院感染管理科工作人员从检验科微生物报告中发现该患者3次分离出CPKP，遂对此菌株进行了重新鉴定和药敏试验，结果与检验科微生物室报告结果相同。感染管理科工作人员对该患者病房环境多位点进行了工作状态下的微生物采样，培养结果显示，患者周围环境带菌量较高，除呼吸机Savina 3接口以及护士手带菌量在合格范围(≤10 CFU/cm2)之内外，其他环境采样标本含菌量均远>10 CFU/cm2。对其中的常见病原菌进行鉴定，发现流量表、柜子表面环境中检出鲍曼不动杆菌，护工手、溶液瓶口、升降扶手、床栏杆均检出CRKP。具体环境各位点采样微生物检测结果见表1。

2.3 病原菌药物敏感试验结果 医院感染管理科工作人员对分离的5株肺炎克雷伯菌(1株来自患者，4株来自于患者所在的病房环境)进行药敏试验，结果显示，5株肺炎克雷伯菌除对头霉素类、氨基糖苷类抗生素的药敏结果不一致外，对其他各类抗菌药物均表现为耐药。见表2。

2.4 改良Hodge试验 5株肺炎克雷伯菌改良Hodge试验均呈阳性，证明5株肺炎克雷伯菌均产生碳青霉烯酶。见图1。

2.5 CIM试验结果 5株肺炎克雷伯菌的抑菌圈均为6 mm，证明5株肺炎克雷伯菌均产碳青霉烯酶，水解美罗培南，使大肠埃希菌ATCC 25922对美罗培南呈现耐药结果。见图2。

表1 患者病房环境中微生物采样菌落计数及肺炎克雷伯菌检出情况

表2 5株肺炎克雷伯菌对抗菌药物的MIC值及药敏试验结果

图1 5株肺炎克雷伯菌改良Hodge 试验阳性

图2 5株肺炎克雷伯菌CIM试验阳性结果

2.6 PFGE结果 根据PFGE图谱判读标准，病房溶液瓶口、床栏杆、病床升降扶手同患者标本分离的肺炎克雷伯菌电泳图谱一致，为同一菌株，而护工手同患者标本分离的肺炎克雷伯菌电泳图谱有2条条带的差异，其菌株间有相近的关系。见图3。

M：为Marker，泳道 1—5分别为K.pn 1—K.pn 5

3 讨论

肺炎克雷伯菌已成为医院感染和免疫缺陷患者感染的重要机会致病菌，可通过患者之间交叉感染或呼吸机等医疗器械传播[13]；碳青霉烯类抗生素是目前治疗肺炎克雷伯菌感染最有效的抗生素[14]，随着此类药物在临床上的广泛应用，对其耐药的肺炎克雷伯菌日益增多。本研究中从患者痰标本多次检出了耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌，为预防和控制该菌株引起的医院感染暴发，医院感染管理科立刻对患者周边环境进行环境卫生学采样监测，从周围环境中共分离出4株CRKP。经改良Hodge试验和CIM试验证实，本组肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶，与文献报道我国泛耐药肠杆菌科细菌耐药机制主要为产生碳青霉烯酶的报告一致[15]。为进一步明确菌株的同源关系，我们采用目前病原菌分子分型的 “金标准”PFGE对其进行分子分型，结果证实5株肺炎克雷伯菌有高度同源性，证明患者分离CRKP极大可能来自于医院环境，或许与医务人员未严格执行相关医院感染控制制度有关。

据世界卫生组织(World Health Organization)报告，在中低收入的国家，医疗机构相关性感染发生率在5.7%～19.1%[16]，可见全球医疗机构相关性感染控制形式仍然严峻，我国作为发展中的中等收入大国，医疗机构相关性感染的控制任务仍然任重而道远。本文作者在日常工作中通过实时监测系统发现CRKP，并及时关注和追踪，通过对患者和医务人员密切接触的环境进行采样，寻找患者CRKP可能的来源，并对患者及时进行隔离，从源头上阻止了医疗机构相关性感染暴发的可能，为其他医疗机构医院感染管理科工作人员在日常工作中及时发现多重耐药，尤其是泛耐药菌，控制医疗机构相关性感染的暴发提供了一个很好的案例。

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(本文编辑：左双燕)

Antimicrobialresistanceprofileandhomologyofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolatedfrompatientsandrelatedsurroundings

YANGZhu-lan1，ZHANGZhen2，LIUZhi-yong1，WUHao1，ZHANGBo1

(1SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China; 2ChongqingPeople’sHospital,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo understand the homology of clinical isolates from patients with carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(CRKP) infection and isolates from environment in a medical institution.MethodsOne CRKP strain isolated from a patient in this hospital and 4 strains ofKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) isolated from patient’s surroundings were collected, susceptibility of 5 strains to commonly used antimicrobial agents was detected, production of carbapenems in 5 strains were detected by modified Hodge testing and carbapenem inactivation method(CIM), homology analysis was performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).ResultsAntimicrobial susceptibility testing results showed that 5 strains ofK.pneumoniae(1 from patient, 4 from the patient’s ward surroundings, including hands of nursing aides, solution bottle opening, handle for lifting and dropping bed, and bedrail) were all resistant to other antimicrobial agents except to cephamycin and aminoglycosides. The modified Hodge testing and CIM confirmed that 5 strains all produced carbapenemases; PFGE results showed that electrophoretogram of CRKP isolated from solution bottle opening of ward, bedrail, and handle for lifting and dropping bed were the same as CRKP isolated from patient, while electrophoretogram of CRKP isolated from hands of nursing aides had 2 different bands, there was a close relationship between the strains.ConclusionThe same type of CRKP were isolated from patient and his surroundings, it is necessary to implement healthcare-associated infection(HAI) control system, isolate infected patient, and strengthen environmental cleaning and disinfection, so as to avoid the outbreak of HAI.

Klebsiellapneumoniae; carbapenems; pulsed-field gel electrophoresis; homology analysis

2017-01-24

国家自然科学基金项目(No.71373280);第三军医大学临床创新基金项目(SWH2013LC08，SWH2014LC31)

杨竹兰(1990-)，女(苗族)，贵州省凯里市人，检验技师，主要从事医疗机构相关性感染研究。

张波 E-mail：zhangbocq@aliyun.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.08.001

R181.3+2

A

1671-9638(2017)08-0693-05