复合菌种酸奶发酵剂的保存

王丹，朱良工，周水明，张筠

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院,哈尔滨150028；2.黑龙江东方学院，哈尔滨150086；3乔富企业有限公司，上海200235）

复合菌种酸奶发酵剂的保存

王丹1，朱良工1，周水明3，张筠2

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院,哈尔滨150028；2.黑龙江东方学院，哈尔滨150086；3乔富企业有限公司，上海200235）

以复合菌种发酵后的酸奶pH值、黏度及感官评分为指标，研究了不同种类辅料、辅料复配比例、菌种包装形式对菌种保存的影响，得出了不同辅料对发酵性能的影响由强到弱分别为：麦芽糊精，海藻糖，无水葡萄糖；选用麦芽糊精与海藻糖两种辅料作为填充辅料进行复配，确定了最佳比例；比较了三边封包装和背封包装对酸奶发酵的影响，确定了最佳包装形式为背封式包装。

发酵；发酵剂；保存

0 引言

菌种资源保藏作为食用菌产业的一项基础工作已受到世界各国的重视，国内外一些高级微生物研究单位均设有菌种保藏机构[1]。在1980年Fran-tisek Kral就开始研究微生物菌种的保藏[2]，Sherf在1943年首次采用矿油保藏法，该方法适用于大多数的真菌，后来被广泛应用[4]。Castellani[3]在1963年首次使用蒸馏水保藏真菌，并且保持菌种遗传性状不发生或尽可能少发生变异[5]。菌种是国家的一类重要资源，保持菌种的优良性能，既可保证菌种的高产稳产，也可提高酸奶的品质[6-7]，其保藏原理是人为创造缺氧、低温或者干燥的条件，降低菌种的新陈代谢，使其生命活动基本处于停滞或者休眠状态，停止生长繁殖的菌种，其遗传物质自然会更加稳定[8]。本文研究了影响菌种保存的各因素，并确定了最佳的菌种保存方法。

1 实验

1.1 材料与仪器

复合菌种发酵剂（嗜热链球菌、保加利亚杆菌、瑞士乳杆菌），麦芽糊精，无水葡萄糖，海藻糖，白砂糖。

电热恒温培养箱DHP-9272，洁净工作台VD-1320，全自动高压灭菌锅HVE-50；DELTA 320 pH计，电子天平PL2002，实验型1003高压均质机，ME5-F精密分析天平，JJ-140W增力电动搅拌器，HH·S11-2S恒温水浴加热器，黏度计，冰箱。

1.2 方法

制作添加不同辅料（麦芽糊精、无水葡萄糖、海藻糖）的酸奶发酵剂，分装成小包，每次可发酵1 L的酸奶，以无辅料添加的可发1 L酸奶的量的发酵剂作为空白对照。分别将每组分装好的样品拿出5包放置在4℃的冰箱中贮藏，每组的另外5包放置在室温（25℃）贮藏，在贮藏后的第1周、第2周、第3周、第4周检测每组样品发酵后的酸奶的pH值变化、酸奶的黏度变化及感官评定。筛选出合适的辅料后，进而试验出恰当的辅料添加量。分别放置不同的温度下，测其贮藏后每周都要酸奶的pH值变化进行评定。

1.2.1 不同辅料添加对菌种保存的影响

以混有麦芽糊精、海藻糖和无水葡萄糖不同辅料的3菌种（菌种量一定、辅料量一定）作为菌种发酵剂，与无辅料添加的空白对比样对比，均置于常温保存，研究不同辅料对发酵剂性能的影响。准备4杯1 L的牛奶，灭菌冷却后，待温度达到43℃时，分别将混有麦芽糊精、海藻糖和无水葡萄糖的菌种和空白对比样接入牛奶发酵，分别编号1#、2#、3#、4#。在43℃的电热恒温培养箱中发酵6 h，自第3个小时开始测pH值变化，后熟过夜后取出，测定黏度，进行评定。每周重复一次，重复4周。

1.2.2 不同辅料添加比例对菌种保存的影响

用混有辅料麦芽糊精与海藻糖的添加量分别为1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1的比例的菌种作为菌种发酵剂，研究添加不同比例的辅料对菌种发酵剂性能的影响。准备5杯1 L的牛奶，灭菌冷却后，待温度达到43℃时，分别将添加不同比例辅料的菌种发酵剂接入牛奶发酵，分别编号1#、2#、3#、4#、5#。在43℃的电热高温培养箱中发酵6 h，自第3个小时开始测pH值变化，进行评定。每周重复1次，重复4周。

1.2.3 不同的保存温度对菌种保存的影响

研究不同温度保存的菌种发酵剂对酸奶发酵的影响。准备4杯1 L的牛奶，灭菌冷却后，待温度达到43℃时，分别接入相同量的在-18℃、4℃和常温下的菌种发酵剂到牛奶中，分别编号为1#、2#、3#。在43℃的电热高温培养箱中发酵6 h，后熟后，每周测试一次进行对比，测试4周，检测其酸度的变化。

1.2.4 不同的包装形式对菌种保存的影响

研究不同包装的菌种发酵剂对酸奶发酵的影响。准备两杯1 L的牛奶，灭菌冷却后，待温度达到43℃时，分解接入三边封包装和背封包装的相同量的菌种发酵剂到牛奶中，分别编号为1#、2#。在43℃的电热高温培养箱中发酵6 h，测pH值变化，过夜后熟后，测黏度并进行感官评定。

1.3 检测方法

1.3.1 酸奶样品酸度的检测

本研究用DELTA 320 pH计对酸奶样品在发酵过程中的pH值曲线进行检测。实验采用发酵过程的酸奶作为介质，自发酵第3个小时开始每隔1 h测1次pH值。

DELTA 320 pH计是利用pH复合电极对被测溶液中氢离子浓度产生不同的直流电位通过前置放大器输入到A/D转换器，以达到pH测量的目的，最后由数字显示pH值。测定值可准确到0.01（pH）的单位。在酸奶发酵过程中，从发酵开始每隔1h测定pH值并记录下来，绘制曲线。

1.3.2 酸奶样品总酸的检测

总酸度是指在食品中的所有酸性成分的总量。它包括没有离解的酸的浓度和已经离解的酸的浓度。它的大小可以用标准碱性滴定来进行测定，所以又可称为“可滴定酸度”。总酸的测定用标准碱液滴定食品中的酸，中和生成盐，用酚酞做指示剂。当滴定终点（pH=8.2，指示剂显红色）时，根据耗用的标准碱溶液的体积，计算出总酸的含量。Lee[9]等也通过测定菌种在发酵牛奶过程中的pH值的变化来评价不同菌株的酸化能力，首先，配置0.1 mol/L NaOH标准溶液，称取4 g的NaOH与96 mL蒸馏水混合震荡溶解，待其冷却后，摇匀。配置好后，密封保存，定期标定。配置1%的酚酞指示剂。称取酚酞1 g溶解于60 mL体积分数为95%的乙醇中，用蒸馏水稀释至100 mL。变色范围pH值（8.2～10.0）。在测量时，用烧杯称取酸奶样品10 g，搅拌均匀，再称取20 g水与其混合均匀，加入酚酞指示剂3～5滴。用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至浅红色且30 s不褪色。记录下消耗的NaOH体积。碱式滴定管在使用前，应先用清水洗净，检查是否有漏液，先用标准溶液进行润洗并排除气泡，才可使用。

发酵好的酸奶4℃冷藏过夜，后熟后测其总酸，每4天测1次，并绘制曲线，测得最佳货架期。

1.3.3 酸奶样品的黏度的测定

用博力飞黏度计检测用不同产酸菌发酵的酸奶样品的黏度的变化。将酸奶样品搅拌均匀，黏度计选用3号转子，转子转速60 r/min，30 s后读数，分别测每个样品的黏度，记录，并绘制曲线。

1.3.4 酸奶样品的感官评定

感官评定小组由20个人组成，男女各半，其中的12名成员是熟悉酸奶感官评定规则的，且有感官评定经验的食品企业研发和品控人员组成，8名是由具有感官评定经验的食品专业学生组成。感官评定小组对的成员要保证有3次以上的品尝次数，然后打分，以提高结果的可靠性。结果取3次品尝后的平均值。酸奶样品在进行感官评定之前要放置在4℃的冰箱里贮存。感官品定要在光线明亮的地方进行，以便观察酸奶的色泽及外观。评价室还应设在集体的工作区，便于评价员之间的讨论。该评价宜在饭后2～3 h内进行，避免过饱或者饥饿的状态下进行。评定小组的成员在检验前的0.5 h内不能吸烟，不得吃具有强刺激性的食物，在进行评定之前要用纯净水漱口。感官评定小组成员要对不同产酸菌发酵后的酸奶样品从色泽、香气、状态和口感上对其进行评定。在色泽方面，优质酸奶的色泽均匀一致，呈乳白色或稍带微黄色；次质酸奶的色泽不均，呈微黄色或浅灰色；劣质酸奶的色泽灰暗或出现其他异常颜色。在组织状态方面，优质酸奶的凝乳均匀细腻，无气泡，允许有少量黄色脂膜和少量乳清；次质酸奶的凝乳不结实也均匀，有乳清析出；劣质酸奶凝乳不良，有气泡。在滋气味方面，优质酸奶有纯正的酸奶味，酸甜可口；次质的酸奶香气较平淡；劣质酸奶有不良滋味。

2 结果与讨论

2.1 不同辅料添加对菌种保存的影响的结果

以混有麦芽糊精、海藻糖和无水葡萄糖不同辅料的3包菌种（菌种量一定、辅料量一定）作为菌种发酵剂，与无辅料添加的空白对比样对比，研究不同辅料对发酵剂性能的影响。结果如图1-图3所示。

[35]Hun Sen,“The Royal Government of Cambodia’s Policies for the Second Term 1998 - 2003”, https://www.embassyofcambodia.org.nz/government_old.htm, 1998年11月23日。

图1 麦芽糊精对菌种发酵剂发酵酸度的影响

图2 无辅料添加的菌种发酵剂发酵酸度

图3 不同辅料添加的菌种发酵剂黏度变化

由图1、图2可以看出，添加麦芽糊精作为保护剂时，分别存储1周～4周后，测定发酵6 h的pH值与无辅料添加的发酵pH值基本一致，添加海藻糖和无水葡萄糖的pH值变化趋势与麦芽糊精基本一致，但添加无水葡萄糖在同等发酵条件下pH值较其他两种辅料和无辅料添加偏高。添加的辅料对冷冻干燥的菌种发酵剂的存活率会产生一定的影响。麦芽糊精的性质即还原能力主要有DE值来决定，且DE值的大小和其平均的分子量成反比[10]。无水葡萄糖是一类不含结晶水的葡萄糖，为有机化合物[11]。海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，由两个葡萄糖分子通过1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质都具有非特异性保护作用[12]。由图3可以看出，采用麦芽糊精、海藻糖、无水葡萄糖作为辅料添加到菌种发酵剂中后，通过与无辅料填充的菌种进行对比，得出麦芽糊精相较于其他两种辅料来说的对于菌种发酵剂的保护效果最好，最为接近无辅料添加的菌种发酵剂的发酵效果。其次是海藻糖，与麦芽糊精的曲线较为接近。由于无水葡萄糖容易吸潮结块，不能保证菌种发酵剂的水分在5%以下，会导致膜和细胞壁的损伤。当菌种发酵剂直投到酸奶中发酵时，包埋在菌种外壁的结块溶解不充分等原因会导致菌种发酵剂细胞的主动运输受到抑制、营养成分得不到充分的利用，也会使菌种变形抑制存活率降低。因此，使用无水葡萄糖作为添加辅料保护的菌种发酵剂发酵的酸奶从第3周开始在发酵6 h后会出现达不到凝固的效果。麦芽糊精和海藻糖不会出现结块的现象，亦对菌种的包埋效果更好，在牛乳中的具有较好的分散性，麦芽糊精的黏结和增稠效果也较好，并且具有较好的热可逆性和伸展性，口感与脂肪极为相似，故可以在酸奶发酵中起到增稠的作用。而且麦芽糊精的泡沫稳定性能也较好。图3中，与空白样对比，由于无水葡萄糖在第3个星期开始酸奶已无法凝固，所以黏度差一些。综上所述，麦芽糊精对菌种的保护作用最好，是菌种的活力几乎不得到衰减。其次是海藻糖，与麦芽糊精的的保护效果相差无几。

2.2 不同辅料添加比例对菌种保存的影响的结果

用混有辅料麦芽糊精与海藻糖的添加量分别为1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1的比例的菌种作为菌种发酵剂，研究添加不同比例的辅料对菌种发酵剂性能的影响。结果如图4所示。

图4 复配比例为5∶5时对菌种发酵剂发酵酸度的影响

由图4可以看出，当麦芽糊精与海藻糖的添加比例为5∶5时，发酵速度最快。在保存4周后，菌种的活力依旧不得到衰减，而比例为1∶9、3∶7、7∶3和9∶1时在第4周发酵6 h后均有无法凝固的现象出现，pH值达不到4.70左右。因此麦芽糊精与海藻糖的比例5∶5为最佳复配添加比例。

选用对酸奶发酵剂稳定性效果较好的麦芽糊精和海藻糖作为辅料。选择两种辅料配合产生不仅便于酸奶发酵菌种的复配生产，而且有利于减少外界环境对菌种活力的影响。有利于保持菌种活力。根据研究出的在酸奶发酵剂中的最适加入量，进行复配实验。复合辅料与单体辅料相比有十分显著的优势，通过辅料的复合，可以发挥各种单一辅料的互补作用，使各种辅料协同增效。复配辅料对酸奶发酵剂的稳定效果比单一的辅料对酸奶发酵剂的稳定效果好。而且在菌种发酵剂中采用适当比例的辅料，能使菌种的效价不会下降，可保存较长时间。比起因添加辅料而额外增加的成本（如辅料加工设备、热能消耗，添加酶制剂等费用）来说，其总成本是降低的。大多数辅料都含有可溶性氮和多酚类化合物很少，因此可降低蛋白质和多酚的含量，改善发酵出的酸奶的风味和提高酸奶的非生物稳定性。使用部分辅助原料可增加酸奶中糖蛋白的含量。通过单体实验已经研究出各种辅料在酸奶发酵剂中的最佳选择。使用麦芽糊精和海藻糖作为辅料，可调节酸奶的可发酵性糖的比例，保证酸奶的色泽，口味爽快。

图5 -18℃下保存对菌种发酵剂发酵酸度的影响

图6 4℃下保存对菌种发酵剂发酵酸度的影响

图7 常温下保存对菌种发酵剂发酵酸度的影响

2.3 不同保存温度对菌种保存的影响的结果

研究不同温度保存的菌种发酵剂对酸奶发酵的影响。结果如图5-图7所示。

由图5-图7可以看出，菌种在-18℃下保存，测试4周，每次发酵6 h后酸奶的pH值均在4.5以下，符合正常发酵规律。菌种在4℃保藏条件下，保存4周的菌种与-18℃下保存的菌种活力略有下降，但下降不明显；在常温下，保存2周仍有较好菌种性能，但保藏到第3周菌种的活力会有明显下降。保存第4周菌种性能严重退化。菌种在低温保藏条件下，菌种细胞代谢缓慢，生长处于休眠状态，菌种保藏时间可适延长，活菌含量随保存温度的降低而呈单峰曲线变化。菌种的保存温度与有效期，与实际生产中的发酵是密切相关的，是菌种大面积扩大使用中的最为关键的问题之一。不同保存温度下的试验，可为酸奶的生产发酵提供数据，并可充分利用菌种的有效期，安排生产，避免为企业造成损失。因此，菌种保存温度的最佳方案为-18℃冷冻保存。

2.4 不同包装形式对菌种保存的影响的结果

研究不同包装的菌种发酵剂对酸奶发酵的影响。结果如图8和图9及表1所示。

图8 不同包装形式的菌种发酵酸度的变化

图9 不同包装形式的菌种发酵黏度

由图8和图9及表1可以看出，背封式包装的菌种的产酸速度、产黏性能和风味物质的产生效果均优于三边封的菌种的包装形式。因为在包装时，背封式在封口时是背部中间和两端受热，使菌种的局部受热面积会大于三边封包装的菌种的局部受热面积，此热度恰巧也会激发菌种的活力，使菌种的活力不但不得到衰减反而有多提升。综上所述，背封式为最佳的菌种包装形式。

表1 不同包装形式的菌种发酵的酸奶的感官评定

在工厂中发酵剂的包装形式不仅对发酵剂产品的外观有影响，而且对菌种的力价也是有一定的影响。相同的发酵剂，选择不同的包装形式对最终发酵剂的保质期也有影响[13]。常用的包装形式有背封式和三边封两种。背封袋也被称之为中封袋，简单的讲就是在袋体的背面进行封边的包装袋。这种形式的包装可以防潮、防水、防止东西散落、可以重复使用，而且柔韧性非常好，非常方便。三边封袋，主要是指三边封口，只留一个开口给用户装产品。对于一般的产品来说，两种包装形式对产品并无太大影响，但对于菌种发酵剂来说，背封和三边封是有一定的区别的，因此研究背封和三边封的包装形式对发酵剂活力的影响及对工厂生产有着十分重要的意义。通过研究这两种包装形式对发酵剂活力的影响，可以了解到最优的包装形式，以便于工厂生产过程中调整包装设备、优化生产，使生产的效益达到最大化。

3 结论

本文对菌种发酵剂的保存进行了研究，结果表明：不同的辅料对菌种的发酵剂的保护作用是不同的，麦芽糊精和海藻糖的保护效果较好。最佳的辅料为麦芽糊精、其次是海藻糖、效果最差的为无水葡萄糖选用两种辅料复配作为菌种保存的保护剂。通过不同比例的复配，麦芽糊精和海藻糖的最佳复配比例为5∶5。通过对菌种发酵剂在不同温度下，不同时间测试其活力，-18℃最适合菌种保存。通过对不同的菌种包装形式的菌种发酵剂的产酸速度、产黏特性和产风味效果进行测定，背封式包装是最佳方案。

[1]冯云利,郭相,邰丽梅,等,桂明英.食用菌种质资源菌种保藏方法研究进展[J].食用菌,2013(4):8.

[2]孔维丽,袁瑞奇,孔维威,等.食用菌菌种保藏历史、现状及研究进展概述[J].中国食用菌,2015(5):1-5.

[3]CASTELLANI A.Further researches on the longviability and growth of many pathogenic fungi andsome bacteria in sterile distilled water[J]. Mycopathologia,1963,20(1):1-6.

[4]SHERF A F.A method of maintainingPhytomonassepedonicain cul⁃tureforlongperiodswithouttransfer[J].Phytopathology,1943,33: 330-332.

[5]刘红,黄建军,许丽娟,魏小武.谈食用菌菌种的保藏[J].现代农业科技，2008(18):122.

[6]张爱梅,郭大城,王建丽,等.国内菌种保藏材料及保藏方法研究现状[A].河南预防医学杂志,2011(6).

[7]KNEIFEL W,ULBERTH F,ERHARD F，et al.Aroma pro?les and sensory properties of yogurt and yogurt-related products[J].Screening of commercially available starter cultures.Milchwissenschaft,1992（47）:362-365.

[8]梁宁利.微生物菌种保藏方法概述[J].农产品加工（学刊），2012(4).

[9]LEE K.Comparison of fermentative capacities of lactobacilli in single and mixed culture in industrial media[J].Process Biochemistry.2005 (40):1159-1564.

[10]吴井志.酯化麦芽糊精的制备工艺、性质和应用研究[D].江南大学，2013:2-5.

[11]王辉,刘剑侠,程平等.医用无水葡萄糖生产中的原料脱色技术研究[J].山东科学，2011(2):50-51.

[12]彭亚峰,周耀斌,李勤，等.海藻糖的特性及其应用[J].中国食品添加剂,2008(11):65-68.

[13]黄宝威,许佳晶,刘彦兰，等.乳酸菌在不同食品包装材料生物膜形成特性[J].食品工业科技,2012(6):363-365.

上海普丽盛集团创新产品暨意大利COMAN集团进军中国市场发布会于吴江召开

2017年7月12日，上海普丽盛集团创新产品发布会暨意大利COMAN集团进军中国市场发布会在苏州吴江同里湖大饭店召开。中共金山区委常委、副区长刘健，中国食品与包装机械协会理事长楚玉峰，中国乳制品工业协会理事长吴秋林，中国奶业协会副秘书长邓荣臻等领导，以及上海普丽盛集团董事长姜卫东、意大利COMAN集团创始人Bruno Grassani、意大利COMAN集团销售总监Gianluca Scaramuzza、普华盛副总经理赵振、上海普狄副总经理张晴，以及全国各行业协会、各地客户代表近400人参加了会议。

上海普丽盛包装股份有限公司专注于乳品、饮料加工及包装设备的研发制造。公司秉承技术创新的理念，引进国内外先进的技术和管理模式，以稳健的步伐向全球客户提供优质的各类设备、包装材料及整体解决方案，形成了以无菌（超洁净）灌装为核心的产业，新近推出了具有自知识产权的系列新品，主要有钻石大包装、晶钻包（方圆包、异形包）、PET或PP瓶果肉乳制品灌装，以及小型PET无菌冷灌装生产线。2017年4月，普丽盛成功收购意大利COMAN集团，其作为欧洲知名的乳品及饮料装备供应商，在无菌或超洁净灌装领域处于领先地位。主要产品有无菌（超洁净）高阻隔HDPE灌装生产线、提供生产线整合及自动化解决方案。在消费升级、产品多元化的时代，这些产品进入市场将会为中国的乳品材料行业升级换代做出贡献。

上海普丽盛集团董事长姜卫东在发布会上讲到，在普丽盛公司的发展规划上，坚持以无菌灌装（或超洁净灌装）作为核心技术，以包材配套引领持续增长，以工程总包作为营销平台，全面走向国际市场。企业将秉持更高更好的理念——创新驱动、环境友好，并注重包装创新，进一步助力产业升级。

意大利COMAN集团创始人Bruno Grassani对COMAN集团进行了简单介绍。意大利COMAN销售总监Gianluca Scaramuzza讲述了无菌灌装技术及应用，用上星期越的设计理念和产品提高企业的竞争力，拥有无菌灌装、机器人包装系统、ADV自动化技术。

普华盛副总经理赵振讲解无菌PET技术及应用，公司提供PET灌装技术，重点服务于无菌冷灌装、中性、酸性无菌液态产品、中性植物蛋白饮料、乳酸菌含乳饮料、超洁净灌装，以及含3～5 mm颗料乳品或饮料产品。公司在PET无菌方面提供的设备有吹瓶机、无菌灌装机、吹灌旋无菌一体机。此外为客户提供增值服务。

上海普狄副总经理张晴针对快消品行业自动化仓库的最佳选择进行讲解，公司的核心业务是后段输送、机器人应用以及智能仓储/自动化仓库。

中共金山区委常委、副区长刘健致辞表示，普丽盛公司于2007年6月成立，是金山区土生土长的骨干民营企业，其拥有的无菌灌装技术打破外国企业在中国市场的垄断，位列金山百强企业之一，为金山区的经济发展做出突出贡献，为金山区民营企业树立榜样，成为实体企业的标杆。此外，各个协会代表针对于普丽盛集团创新产品发布会暨意大利COMAN集团进军中国市场发布会的成功启动表示祝贺，并致辞。

Strain preservation research

WANG Dan1,ZHU Lianggong1,ZHOU Shuiming3,ZHANG Yun2
(1.Green Food Science Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150028;2.Heilongjiang Oriental College, Harbin 150086,China；3.Georgefood enterprise co.,LTD，Shanghai 200235,China)

With compound strains fermentation yogurt pH value,viscosity and sensory evaluation as an index.The proportion of different kinds of accessories,accessories,strains of packaging effect on strain preservation.It is concluded that the influence of different excipients on the fermentation performance from strong to weak performance were:maltodextrin,trehalose,anhydrous glucose.We choose maltodextrin and trehalose two kinds of materials as filling materials,and for the two materials with different proportions of the complex determined the best ratio of 1∶1.Compare three edge sealing packing and back sealing effect on yogurt fermentation, to determine the best form for the packing sealing packing.

fermentation;starter cultures;preservation

Q935,TS252.54

：A

：1001-2230（2017）07-0060-05

2016-09-13

王丹（1963-），女，研究员级高级工程师，从事乳品加工技术的研究。

朱良工