标准曲线法测定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效价

方韵

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215100）

标准曲线法测定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效价

方韵

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215100）

目的：探讨用标准曲线法测定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效价。方法：利用标准曲线法测定其效价，与《中华人民共和国药典》（2015年版）四部规定用抗生素微生物检定法二剂量法测定其效价进行比较。结果：标准曲线法测定其浓度在3.2～7.81 U/mL范围内菌圈清晰，标准品所致抑菌直径平均值的校正值与抗生素浓度对数线性关系良好（r2＝0.998 7）。结论：本法与二剂量法比较，结果无显著性差异、准确，重复性好。

标准曲线法；抗生素效价；注射用硫酸核糖霉素

硫酸核糖霉素为氨基苷类广谱抗生素，对革兰阳性、阴性菌均有抑制作用，对葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、大肠杆菌和部分变性杆菌菌株有效，抗菌作用较卡那霉素略弱。本品对绿脓杆菌、结合杆菌无效[1]。由于氨基苷类抗生素无特征紫外吸收[2]，不能直接采用传统HPLC-UV法测定，《中华人民共和国药典》（2015年版）四部规定用抗生素微生物检定法—管碟法（二剂量法[3]）测定其抗生素微生物活性（效价）[4]，本文采用标准曲线法[5-7]测定其效价，效果较好，结果满意。

1 主要仪器与试剂

1.1 仪器

CAM-IIIB智能型抑菌圈测定仪（上海波浦电脑系统工程有限公司），LMQC-80E立式高压灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），E240分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，GNP-9270隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），定量培养皿（直径90 mm），牛津杯，陶瓦盖等。

1.2 试剂和药品

抗生素检定Ⅰ型培养基（pH 7.8～8.0，批号：130301，来源：中检院），枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]，核糖霉素标准品（批号：130348-9301，含量：695 U/mg，来源：中检院），注射用硫酸核糖霉素（批号：15092941，15092942，15092943，来源：江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂）。

2 试验方法与结果

2.1 缓冲液、菌悬液及双碟制备

磷酸盐缓冲液（pH 7.8）：取磷酸氢二钾5.59 g与磷酸二氢钾0.41 g，加水使成1 000 mL，滤过，在115℃灭菌30 min。

菌悬液制备：将枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7天，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30 min，备用。取适量菌悬液，用灭菌水稀释至培养基储备混悬液的比例直到满意的抑菌区域（中间浓度S3的抑菌直径约为14～16 mm）。

双碟制备：取直径约90 mm，高16～17 mm的平底双碟，分别注入20 mL加热融化的抗生素培养基，使碟底内均匀摊布，放置水平台上使其凝固，作为底层；另取含菌液的培养基5 mL倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。在每一个双碟中以等距离均匀放置牛津杯6个，用陶瓦圆盖覆盖，备用。

2.2 标准曲线制备

2.2.1 中心浓度的选择 根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，在抗生素项下规定的剂量与反应线性范围内选择一个中间浓度S3＝5 U/mL。

2.2.2 标准溶液浓度的确定 依照标准品说明书规定，将标准品溶液按等比级数稀释。计量间的距离为1∶1.25，算出中间剂量邻近的高低2个浓度，S3＋1及S3－1，再分别计算各剂量的浓度，各浓度分别为3.20，4.00，5.00，6.25，7.81 U/mL。

2.2.3 标准核糖霉素溶液的制备 精密称取核糖霉素标准品，用灭菌水制成1 000 U/mL，精密吸取20 mL至200 mL量瓶中，加磷酸缓冲液（pH 7.8）稀释制成100 U/mL。再分别精密吸取3.20，4.00，5.00，6.25， 7.81 mL至100 mL量瓶中，用pH 7.8磷酸缓冲液稀释至刻度，制成中间浓度为5 U/mL及Si（i1-i5）各浓度的标准溶液。

2.2.4 标准品测定 取已制备的标准品溶液S1，S2，S3，S4，S5，其中S3为标准品中间浓度5 U/mL，除S3外，将标准品分为1，2，3，4个组，每组3～5个碟子，每个碟子放置6个牛津杯，如图1所示。在1，2，3，4组的每个碟子的1#，3#，5#中滴入S3，在2#，4#，6#中分别滴入S1，S2，S4，S5在36～37℃下培养16～18 h，测得每个抑菌圈直径。

2.2.5 供试品测定 将供试品稀释成与标准品中间浓度S3一致的浓度U（5 U/mL），如图2所示。在1，2，3，4组的每个碟子的1#，3#，5#中滴入S3，在2#，4#，6#中滴入供试品U（5 U/mL）。在36～37℃下培养16～18 h，测得每个抑菌圈直径。

图1 各标准品摆放位置

图2 供试品摆放位置

2.2.6 进行初始计算及变异性的适用性检查 对于每种浓度的3个碟，分别求出对应的9个中间浓度标准品的平均值XR及各组求得的总平均值P。分别求出S1，S2，S4，S5所致抑菌圈直径的9个Si平均值XS，然后求出每3个碟得到的9个数值的标准偏差，进而计算出其相对标准偏差（RSD，该值应不超过10%）[5]，结果见表1和表2。

2.2.7 进行碟间的差异校正 令

可得出4组双碟的4个反应参数，列于表2（其中XC＝标准品平均值的校正值；XS＝原始的标准品的平均值；XR＝对照值的平均值；P＝校正值）[5]。

2.2.8 建立标准曲线 以标准品所致的抑菌直径平均值的校正值XC为纵坐标，相应标准品浓度的对数值为横坐标，进行线性回归，见表3，得回归方程：

见图3。

表1 硫酸核糖霉素标准曲线试验数据—中间浓度S3所致的抑菌圈直径平均值XS及P值

表2 硫酸核糖霉素标准曲线试验数据—S1，S2，S4，S5所致抑菌圈直径平均值XR及XC值

表3 标准曲线数据表

图3 线性回归结果

3 结果

3.1 供试品效价的测定

与制备中心浓度的标准溶液同法操作制备供试品溶液，供试品溶液的浓度为5 U/mL，在36～37℃下培养16～18 h，测得各抑菌圈的直径，分别求得供试品溶液抑菌圈直径的平均值，通过线性方程，计算出供试品所含效价（U/mL），再通过与对照中心浓度比较，得出供试品百分比含量（%）。

本文按此方法测定三批注射用硫酸核糖霉素（批号：15092941，15092942，15092943），并与二剂量法进行比较，结果见表4。

表4 两种方法测供试品结果比较

3.2 重现性试验

取注射用硫酸核糖霉素（批号：15092941），按本法测定3次，测得值为98.2%，97.6%，99.3%，其平均值为98.3%，相对标准偏差（RSD）为0.88%。

4 讨论

管碟法是国内外常用的抗生素检定法[8]，《中华人民共和国药典》（2015年版）四部规定的抗生素效价测定法其原理是根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直经（面积）呈线性关系，比较标准品（S）与供试品（T）两者对接种的特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现透明的抑菌圈大小，计算出供试品的效价[3]。因为实验过程中影响结果的因素较多，任何一个环节操作不当或疏忽就会造成很大误差，甚至导致整组实验的失败[8-9]。

用标准曲线法测定效价与二剂量法相比较，可以减少检验过程中的变异性，在数天得到的一系列小的、独立的综合含量结果，与相同数量的碟或比色管得出的单一的、大的含量结果比较，其评估的效价更科学。

本文用标准曲线法测定注射用硫酸核糖霉素抗生素效价，选择标准品中间浓度为5 U/mL，加菌液适量可现直径在14～16 cm的菌圈，其抑菌圈较边缘为清晰。而且与二剂量法相比较，结果没有显著性差异，实验过程虽然繁琐，但结果准确，重现性好。

[1] 吴丽辉.硫酸核糖霉素无菌喷雾工艺的改进[J].福建化工,2005,4(4):25-26.

[2] 王舒,高永良.氨基糖苷类药物研究新进展[J].解放军药学学报,2009,25(4):329-333.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版)四部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:160-165.

[4] 国家药典委员会.卫生部颁药品标准(抗生素药品第一册)[S].1989:89.

[5] The United States Pharmacopeial Convention. Biological Tests/＜81＞ Antibiotics-Microbial Assays USP39-NF34[S].2016:143-161.

[6] 乔晓芳,杨景秀.标准曲线法测定土霉素片的抗生素效价[J].中国医药指南,2014,12(35):72-73.

[7] 高岚,姜凤丽,秦朝英,等.标准曲线法测定硫酸多粘菌素B的抗生素效价[J].化学分析计量,2009,18(4):80-81.

[8] 蒋惠岚.管碟法测定抗生素效价的影响因素及控制方法[J].中国兽药杂志,2011,45(8):53-55.

[9] 胡向东.生物检定法测定抗生素效价的因素分析[J].黑龙江医药,2011,24(1):105.

本文编辑：鲁守琴

Determination of Antibiotic Titer of Ribostamycin Sulfate for Injection by Standard Curve Method

Fang Yun
(Suzhou Institute for Drug Control, Jiangsu Suzhou 215100, China)

Objective：To investigate the determination of antibiotic titer of ribostamycin sulfate for injection by standard curve method. Methods：The antibiotic titer of ribostamycin sulfate for injection was determined by standard curve method, and the result was compared with that by 2-dose assay in antibiotics microbial test in Chinese Pharmacopeia (Volume Ⅳ, 2015 edition). Results：Standard curve method showed that the bacterial inhibition rings of the standard at the concentrations of 3.2～7.81 U/mL were clear, while the calibration value of the average diameter of bacterial inhibition rings caused by the standard substance showed a good linear relationship to the logarithm of antibiotic concentrations (r2＝0.998 7). Conclusion：The determination result by standard curve method showed no signifcant difference with that by 2-dose assay, indicating high accuracy and reproducibility of standard curve method.

Standard Curve Method; Antibiotic potency; Ribostamycin Sulfate for Injection

R927

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.015

2017 - 04 - 12

方韵，女，硕士，主管药师。研究方向：药品质量检测与分析。E-mail：32315503@qq.com