葛仙米生长的尺度效应

赵 雪潘婷婷米武娟毕永红胡征宇

(1.中国科学院水生生物研究所中国科学院藻类生物学重点实验室, 武汉 430072; 2.中国科学院大学, 北京 100049)

葛仙米生长的尺度效应

赵 雪1,2潘婷婷1,2米武娟1毕永红1胡征宇1

(1.中国科学院水生生物研究所中国科学院藻类生物学重点实验室, 武汉 430072; 2.中国科学院大学, 北京 100049)

为考察葛仙米(Nostoc sphaeroides)群体粒径变化对营养成分和光合活性的影响, 测定了生长过程中不同粒径群体的色素成分、光合特性和多糖含量。结果表明: 叶绿素a、藻胆蛋白含量随群体粒径增大而降低; 类胡萝卜素含量在粒径4.85 mm时最高, 藻蓝蛋白/叶绿素a、藻红蛋白/叶绿素a以及别藻蓝蛋白/叶绿素a的比值随粒径增大先降低后升高; 最大潜在光合能力(Fv/Fm)随群体粒径增大逐渐降低, 大群体可通过光系统I介导的环式电子传递链耗散多余能量以保护光合作用系统; 多糖含量在粒径3.03 mm时最高。研究结果显示葛仙米生长具有明显的尺度效应, 细胞组分与光合活性对群体粒径变化具有显著的响应, 开展规模化培养和采收需要关注这一效应。

葛仙米; 群体粒径; 叶绿素荧光活性; 代谢产物

葛仙米(Nostoc sphaeroides)又名拟球状念珠藻, 是一种多细胞球形群体, 具有固氮作用, 与地木耳(Nostoc commune)、发菜(Nostoc flagelliforme)同属蓝藻门(Cyanophyta)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、段殖藻目(Hormogonales), 念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻属(Nostoc)。葛仙米主要分布在湖北鹤峰走马镇的稻田中, 呈墨绿色, 当地人又称其为天仙米[1,2]; 其干物质总蛋白含量为28.38%—52%, 含18种氨基酸, 包括人体必需的8种氨基酸; 富含VC、VE和B族维生素, 总糖为24.19%[3,4], 是一种营养价值高的保健食品。在我国, 葛仙米具有悠久的食用与药用历史; 葛仙米作为席间美食, 其色翠碧可爱, 其味清新甘鲜, 不仅营养极为丰富, 而且还具有较高的食疗价值, 葛仙米性味甘、淡、寒, 有清热明目作用, 能治目赤红肿、夜盲症、烫伤。据《药性考》: “(葛仙米)清神解热, 痰火能疗, 且久服延年。”《全国中草药汇编》记载: 葛仙米性寒。味淡, 可以清热、收敛、益气、明目和能治疗夜盲症、脱肛以及外用可治疗烧伤、烫伤等疾病。

尺寸大小是影响生长速率和生命过程的重要参数之一, 藻类群体大小和代谢速率间的关系已受到广泛关注[5—7]; 个体小的藻类具有较薄的扩散临界层、较少的拥挤效应(Package Effect)以及较高的表面积体积比[8], 研究表明小粒径个体较高的代谢速率主要得益于较小的自遮光效应以及同外界的快速物质交换能力; 大粒径个体扩散临界层厚, 离表面不同厚度的细胞光合特性不同, 最大光合作用速率和光合效率都随群体生物量和厚度的增加而降低[9,10]。葛仙米属于多细胞群体结构, 多细胞丝状体包裹在一层共同的胶质鞘内, 生长至一定粒径时, 群体内部出现明显的分层现象[11], 形成层状结构, 共同构成一个肉眼可见的坚固群体, 野生群体粒径可达2 cm。小群体有较高的最大光合作用速率, 较快的生长速率和失水率; 大粒径群体的最大光合作用速率以及对无机碳的亲和力较低[12]。目前, 得到公认的是葛仙米因粒径差异导致光合作用活性的差异, 最终影响葛仙米群体活性物质含量的差异。但光合色素含量与比例如何适应粒径增长过程、不同粒径如何影响光合作用和活性物质积累、规模化培养的适宜采收时机等问题目前缺乏必要的数据。为此, 本文考察了培养过程中葛仙米粒径变化过程, 比较了不同粒径的光合色素含量与比例、确认粒径大小影响色素含量与比例且色素变化直接影响光合特性和活性物质积累, 证实了葛仙米生长过程中存在尺度效应。同时, 本文的研究结果可为葛仙米规模化培养的适宜采收节点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻体培养

选取外表光滑均匀, 色泽饱满的葛仙米, 用灭菌BG-110培养液反复冲洗, 在无菌工作台利用匀浆器研磨制种, 分别接种在培养皿中, 置日光灯下培养, 光强设定为40 μmol photons/(m2·s), 7d后接种至10 L的BG-110液体培养基中, 通气培养, 光强设为60 μmol photons/(m2·s), 每隔14天更换1次培养基。

1.2 群体粒径增幅

每天选取30个群体用游标卡尺测定群体粒径大小并计算粒径大小平均值(L)作为当天的群体粒径, 第t天的粒径(Lt)相对于第1天的粒径(L1)增幅(γ1)采用公式γ1=(Lt–L1)/L1×100%进行计算; 则每天的粒径增幅(γ2)采用公式γ2=α/t进行计算。

在葛仙米培养过程中, 分别选取不同粒径的群体进行了相关指标的测定, 这些群体包括粒径小于1 mm的G1群体, 粒径在1—2 mm的G2群体, 粒径在2—4 mm的G3群体, 粒径在4—6 mm的G4群体, 粒径在6—8 mm的G5群体。

1.3 叶绿素a、类胡萝卜素和藻胆蛋白的含量测定

称取100 mg干重的葛仙米, 加入20 mL 100%甲醇, 避光60℃水浴30min, 4024.8×g下离心10min, 取上清液, 反复抽提2—3次后, 在紫外可见分光光度计下测定665 nm处的吸光度, 叶绿素a (Chl.a)的含量按照公式C (Chl.a)(mg/mL)=A665/A74进行计算;

类胡萝卜素含量的测定按照Schere等[13]的方法, 按照上述方法提取叶绿素a的方法提取得上清后, 加入14 mL石油醚和2 mL乙醚萃取, 在4℃下避光冷藏过夜后, 分离醚层, 测定453 nm处光度值, 并按照公式: C (Car)(mg/mL)=A453/250, 计算类胡萝卜素含量。

称取100 mg干重的葛仙米, 将样品置于–20℃冰箱中冷冻过夜, 次日用超声波融化破碎15min, 反复冻融并研磨至藻体变绿, 冻出液不再有颜色。用5 mL pH 7.2的磷酸缓冲液提取, 11180×g下离心2min, 取上清液用紫外分光光度计分别测定562、615和652 nm处吸光度, 根据公式计算藻胆蛋白含量[14]。

1.4 叶绿素荧光和P700测定

采用Dual-PAM-100叶绿素荧光仪(Walz, Germany)进行活体叶绿素荧光的测定。获得参数最大潜在光化学效率(Fv/Fm)[由公式Fv/Fm=(Fm–F0)/ Fm计算]、光合作用引起的荧光淬灭(qL)、PS II非调节性能量耗散的量子产量[Y(NO)]。

P700活体测定采用Dual-PAM-100叶绿素荧光仪进行, 在暗适应15min后使用远红光照射10s, 然后用饱和脉冲[10000 μmol photons/(m2·s)]测定Pm。获得以下数据: 光系统Ⅰ的电子传递速率[ETR(Ⅰ)]、光系统I非调节性能量耗散的量子产量[Y(NA)]、光系统Ⅰ调节性能量耗散的量子产量[Y(ND)]。

1.5 多糖含量测定

按照文献[15]优化的提取方法提取葛仙米多糖, 称取2 g干重葛仙米, 用碱酶复合进行预处理: 0.4 mol/L NaOH处理2h后中和至中性, 以1 mg/ 100 mg的比例加入木瓜蛋白酶液。采用料液比1鲶90, 温度90℃, 提取2h, 反复提取两次的方式提取粗多糖, 得到葛仙米浸提液进行进一步的纯化。

称取0.25 g木瓜蛋白酶加少量水溶解后加入浸提液中, 搅拌均匀后40℃下水浴8h, 再将sevag试剂(三氯甲烷与正丁醇4鲶1)与酶解后的浸提液1鲶1混合置于分液漏斗中, 反复震荡摇匀后静置12h分层, 放出下层sevag试剂和泡沫层, 除去泡沫层后再次加入sevag试剂重复此操作3次。在旋转蒸发仪中将处理后的液体蒸发至原体积的1/4后, 用95%的乙醇进行醇沉, 使乙醇的终浓度达到60%, 4℃中静置过夜, 然后离心回收沉淀, 采用真空冷冻干燥机收集沉淀多糖。

采用苯酚硫酸法测定多糖含量, 本实验中葡萄糖的标准曲线为: y=0.0077x–0.0083 (R2=0.999)

1.6 数据分析

本文数据整理使用SPSS 22软件进行, 采用oneway ANOVA和LSD多重比较方法对不同组间的统计意义进行检验。

2 结果

2.1 群体粒径的变化

接种粒径小于1 mm、Chl.a含量0.05 mg/L的藻种后, 群体粒径随时间延长不断增大, 但粒径平均增长速率则随培养时间延长而逐渐降低(表 1):培养25d后每天的平均粒径增长速率显著低于15d、10d和5d时的平均增长速率, 群体粒径变化呈现两个显著不同的阶段。

按照不同粒径将葛仙米群体分为5组, 不同组别的含水量和表面积体积比如表 2所示, 随粒径增大, 含水量升高, 表面积体积比显著下降。

2.2 色素含量与比例

色素含量由图 1可见, 随葛仙米群体粒径增加, 叶绿素a含量呈降低趋势, 粒径小于2 mm的群体中叶绿素a含量最高, 随群体粒径增大, 叶绿素a含量显著下降。

图 2显示随群体粒径增加, 类胡萝卜素含量呈现先升高后降低的趋势; G1、G2组别间的类胡萝卜素含量差异性不显著(P>0.05), 当粒径大于2 mm后(G3、G4组别)类胡萝卜素含量显著上升, 峰值出现在G4, 即粒径在4—6 mm的葛仙米群体类胡萝卜素含量最高; 当粒径大于6 mm(G5)类胡萝卜素含量相较于G4显著下降(P<0.05)。

粒径小于1 mm的群体(G1)的藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)和藻红蛋白(PE)的含量最高, 随粒径增大, 各类藻胆蛋白含量均呈下降趋势, 不同组别间差异性显著如图所示, 3种藻胆蛋白均表现为G1、G2、G3之间差异显著(P<0.05), 但G3、G4和G5之间差异不显著(P>0.05)。此外, 不同群体粒径下的藻胆蛋白的比例不同, 当群体粒径小于1 mm时(即G1)PC>PE, 当粒径大于1 mm后, PE的含量所占比例有所上升, 表现为PE>PC (图 3)。

表 1 葛仙米群体的粒径增幅Tab.1 The colony diameters of Nostoc sphaeroides during its growth

表 2 不同粒径群体的含水量、表面积体积比Tab.2 Water content and ratio of surface area/volume in Nostoc sphaeroides with different diameters

图 1 不同粒径群体的叶绿素素a含量差异Fig.1 The content of chlorophyll a in Nostoc sphaeroides with different diameters

图 2 不同粒径群体的类胡萝卜素含量差异Fig.2 The content of carotenoid in Nostoc sphaeroides with different diameters

图 3 不同粒径群体藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白含量的差异Fig.3 The content of phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin in Nostoc sphaeroides with different diameters

色素比值各类光合色素比例随葛仙米群体粒径增大有一定变化, 藻蓝蛋白/叶绿素a, 藻红蛋白/叶绿素a以及别藻蓝蛋白/叶绿素a均随粒径增大而先降低后升高, 类胡萝卜素/叶绿素a比例随粒径的增大而升高(图 4)。

2.3 光合特性

光系统Ⅱ活性随群体粒径增大, 最大潜在光化学效率(Fv/Fm)呈阶梯式降低, 不同处理组间差异如图所示, 可见粒径小于3 mm的群体(即G1、G2)Fv/Fm值最高, 粒径超过3 mm后Fv/Fm显著下降(G3、G4)(P<0.05), 当粒径超过6 mm后出现进一步的显著下降, 在粒径大于8 mm的群体中, Fv/Fm值仅为0.3左右。光合作用引起的荧光淬灭(qL)亦随群体粒径的增大而降低, G2、G3和G4之间差异不显著(P>0.05), 粒径大于6 mm后qL显著降低(P<0.05);非调节性能量耗散的量子产量[Y(NO)]在葛仙米群体粒径大于1 mm后就出现显著增加, 群体粒径高于6 mm后进一步显著增大(P<0.05)(图 5)。

光系统Ⅰ活性光系统I电子传递速率[ETR (Ⅰ)]先随群体粒径增大而显著升高(P<0.05), G3、G4之间的差异不显著(P>0.05), ETR(Ⅰ)在直径大于6 mm(G5)时达到峰值; PSI非光化学量子产量大小的Y(NA)随群体粒径增大而降低, 同样G3、G4之间的差异不显著(P>0.05); Y(CEF)代表环式电子传递链的大小, 随粒径增大先呈阶段性升高的趋势:相较于G1、G2、G3和G4的Y(CEF)显著升高(P< 0.05), 但G2、3、4之间差异不显著(P>0.05), 当群体粒径大于6 mm(G5), Y(CEF)进一步升高(图 6)。

图 4 群体粒径对不同粒径的色素比值的影响Fig.4 The content and portion of photosynthetic pigments in Nostoc sphaeroides with different diameters

快速光响应曲线粒径小的群体在高光强下保持较高的电子传递速率(rETR), 随群体粒径增大, 电子传递速率随光强增大呈下降趋势, 尤其是当群体粒径超过4 mm时, 随光强增大rETR下降趋势更为明显(图 7)。粒径小的群体具有最大的光合速率和光能利用效率, 光抑制系数最小, 随粒径增大, 葛仙米群体的最大光合速率和光能利用效率下降, 光抑制系数增大, 粒径最大的群体(G5)的最大光合速率仅为G1的29.42% (表 3)。

图 5 不同粒径葛仙米群体最大潜在光化学效率(Fv/Fm)、光合作用引起的荧光淬灭(qL)、非调节性能量耗散的量子产量[Y(NO)]的差异Fig.5 The values of Fv/Fm, qL and Y(NO) in Nostoc sphaeroides with different diameters

2.4 多糖积累

随群体粒径增加群体多糖含量先升高后降低(图 8), 峰值出现在G3中, 即粒径为2—4 mm的群体中, 粒径小于1 mm时(G1)多糖含量最低, 此后随粒径增大而显著升高, G3、G4之间差异不显著(P>0.05),但当粒径大于6 mm时(G5), 群体中多糖含量显著下降(P<0.05)。

3 讨论

3.1 色素含量的尺度效应

一般认为个体小的藻类有较快的增长速率, 在本研究中也发现, 个体小的葛仙米群体粒径增长速率快, 增幅大, 随培养时间延长, 葛仙米群体增长速率逐渐降低, 粒径增幅逐渐变小(表 1), 不同粒径葛仙米群体叶绿素a色素含量随粒径增大而下降(表2), 一方面可能是由于粒径增大含水量升高, 单位鲜重中色素所占比例降低, 另一方面是由于自遮光效应使群体内部的光能减少, 细胞内叶绿素a含量发生适应性降低; 与邓中洋等[16]得到的结果一致。

类胡萝卜素是植物光合作用的辅助色素, 在保护细胞免受强光、活性氧和敏化色素的有害影响中起着重要的作用[17], 在葛仙米群体中, 类胡萝卜素含量随粒径增大先升高后降低(图 2); 类胡萝卜素含量升高表明葛仙米群体应激性地响应因群体增长引起的外界环境不适; 粒径大于8 mm后类胡萝卜素含量显著下降说明更大粒径群体可能存在除类胡萝卜素之外的其他保护机制或者新的适应机制, 值得进一步探讨。

藻胆体是蓝藻中重要的捕光色素, 具有较高的能量传递效率[18]; 葛仙米群体中藻蓝蛋白/叶绿素a,藻红蛋白/叶绿素a以及别藻蓝蛋白/叶绿素a的比例在粒径大于4 mm后增大(图 4), 说明在群体粒径较小, 葛仙米群体内部尚未出现自遮光效应时, 藻胆蛋白与叶绿素a的比例保持在较低水平; 随粒径增大群体内部出现自遮光效应, 大群体中光合色素的比例发生了显著变化: 参与捕获光能藻胆体的比例增高, 藻胆蛋白与叶绿素a的比例相应升高, 增强了葛仙米大群体内部藻细胞捕获光的能力。此外, 藻胆蛋白组成也随群体大小发生了变化, 这是由于蓝藻中存在补色适应性, 可通过调整不同藻胆蛋白间的比例来适应不同颜色的光质, 小群体中PC所占比例最高, 在大群体中则是PE所占比例最高, 因为PE吸收光谱在490—570 nm, PC的吸收光谱在620 nm处, 根据量子光学理论, 光波长越长能量越低[19], 因此PE所能捕获的光子能量最高, PC较低, 说明大群体为了适应逐渐减弱的光强而逐渐提高了PE的含量以捕获波长更短穿透性更强的光子。

图 6 不同粒径葛仙米群体光系统Ⅰ电子传递速率[ETR(Ⅰ)]、PSI非光化学量子产量大小的Y(NA)、环式电子传递链大小[Y(CEF)]的差异Fig.6 The values of ETR (Ⅰ), Y (NA), Y (CEF) in Nostoc sphaeroides with different diameters

图 7 不同粒径葛仙米群体快速光响应曲线的差异Fig.7 The light response curve of Nostoc sphaeroides at different diameters

表 3 不同粒径葛仙米群体的最大光合速率Pm、光能利用效率α和光抑制系数βTab.3 The parameters of Pm, α, β in Nostoc sphaeroides with different diameters

图 8 不同粒径群体相对多糖含量的差异Fig.8 The relative content of polysaccharide in Nostoc sphaeroides with different diameters

3.2 光合特性的尺度效应

在本研究中, 葛仙米群体光合能力随粒径增大而逐渐降低(图 5), 主要体现在群体大最大潜在光合能力(Fv/Fm)、光合作用引起的荧光淬灭值(qL)均随粒径增大而显著下降, 这和他人的结果类似。Dodds等[9,10]认为在同一个藻群体中, 距离表面不同位置的细胞光合特性不同, 因此当以群体作为研究对象时, 最大光合作用速率Pm和α都随群体生物量和厚度的增加而降低, 造成这种现象的原因一方面是由于自遮光效应导致到达群体内部的光强降低,另一方面是由于大群体有更厚的扩散临界层, 导致物质交换速率受限而出现生理活性降低[20], 一般认为引起Fv/Fm降低可能有两方面的原因: 光损伤和热能耗散[21], 在本研究中, 随粒径增大, 非调节性能量耗散的量子产量[Y(NO)]显著升高, 光合速率和光抑制系数下降(表 3、图 7)。同时, 粒径较大的葛仙米群体虽然光合活性更低, 但仍能缓慢生长, 得益于电子传递速率的增高[22], 我们发现葛仙米群体的光系统Ⅰ传递速率、环式电子链大小均随群体粒径增大而升高(图 6), 说明大粒径群体可通过光系统Ⅰ介导的环式电子传递链耗散多余的能量[23],保护光系统免受损伤。可见, 葛仙米群体的光合特性表现出对不同粒径的适应性特征。

3.3 活性物质积累的尺度效应

藻类大规模培养过程中, 针对不同目标产物常常采取不同的培养方式[24], 以获得最大效益。葛仙米的大规模培养已初具规模[11], 藻类培养需要消耗营养和能量, 为获得最大效益, 需要确定最佳采收时间节点, 以节省培养成本。

在本研究中发现, 随群体粒径增大, 多糖含量先升高后降低, 在群体粒径3.03 mm时出现峰值(图8), 在工业化大规模培养葛仙米时, 长时间的培养会消耗藻类群体内部的胞外多糖, 并给培养增加不必要的时间和物料成本; 若以多糖作为目标产物,则在粒径3.03 mm时采收会有最大收益。藻胆蛋白也是一种潜在的生物活性物质[25], 本研究发现藻胆蛋白的含量随葛仙米群体粒径的增大而降低(图 3),所以若亦藻胆蛋白为目标产物, 则在粒径0.77 mm时即可采收, 此时藻胆蛋白含量最高, 同时, 类胡萝卜素作为一种重要的天然色素, 可作为工业中安全的添加剂, 某些类胡萝卜素(β-胡萝卜素)还是重要的保健品[26]。在本研究发现类胡萝卜素的含量随藻体粒径的增大而先升高后降低, 峰值出现在粒径为4.85 mm左右的群体中(图 2), 此时采收葛仙米群体作为提取类胡萝卜素具有最大收益。

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THE SIZE EFFECTS OF NOSTOC SPHAEROIDES DURING ITS GROWTH

ZHAO Xue1,2, PAN Ting-Ting1,2, MI Wu-Juan1, BI Yong-Hong1and HU Zheng-Yu1
(1.The Key Laboratory of Algal Biology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

This study investigated nutrients component, photosynthetic activities, pigments components, polysaccharide contents and photosynthetic activities during the colony size variation of Nostoc sphaeroides.The result showed that the content of chlorophyll a and phycobiliprotein decreased with increased colony particle size.The maximum content of carotenoid was occurred in colonies with particle size 4.85 mm; the phycobiliprotein contents was the highest in colonies with particle size 0.77 mm; the maximum content of polysaccharide was occurred in colonies with particle size 3.03 mm; the proportion of phycocyanin/chlorophyll a, phycoerythrin/chlorophyll a and allophycocyanin first increased and then decreased with the enhanced colony particle size; the maximum potential photosynthetic capacity (Fv/Fm) reduced with the increase of colony particle size.Colonies with smaller size were more tolerant to high light intensity than larger ones, and the high rate of cyclic electron transport of the colonies with large particle size can dissipate excess energy to counter the damage caused by the high light.The growth of Nostoc sphaeroides shows size effect and the cell component and photosynthetic activities mediate colony size variation, which are important to concern the mass of start culture and the harvest time of Nostoc sphaeroides.

Nostoc sphaeroides; Colony particle size; Photosynthetic activities; Metabolite

Q948.1

A

1000-3207(2017)04-0923-07

10.7541/2017.115

2016-03-07;

2017-01-14

国家自然科学基金(31123001); 中国科学院璀璨行动计划资助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31123001); Chinese Academy of Sciences CuiCan Action Plan]

赵雪(1991—), 女, 湖北十堰人; 硕士研究生; 主要从事藻类生理学研究。E-mail: zhaoxue258@gmail.com

毕永红, E-mail: biyh@ihb.ac.cn