极端酶研究进展及其在食品工业中的应用现状

刘欣，魏雪，王凤忠，辛凤姣

中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193

极端酶研究进展及其在食品工业中的应用现状

刘欣，魏雪，王凤忠，辛凤姣

中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193

辛凤姣，博士，博士生导师，研究员，中国农业科学院农产品加工研究所食品酶研究与应用创新团队首席科学家，中国农业科学院青年英才，中国农学会食物与营养专业委员会副秘书长。长期从事农产品加工领域关键酶的生化性质及晶体结构研究，微生物代谢调控研究，酶制剂等生物制品开发等。主持创新工程、自然科学基金面上项目等项目5项；发表高水平论文10余篇，申请国家发明专利6项。E-mail: xinfengjiao@caas.cn

酶是一种高效的生物催化剂，因其反应条件温和、能耗低、特异性强、绿色环保等优势而广泛应用于食品、纺织、饲料、医药、能源等各个领域中。随着食品工业的迅猛发展，食品制造绿色化的需求急剧增加，食品酶在整个酶制剂市场中所占的份额日益越大。大部分食品加工工艺都涉及高温、高压等较为严苛的条件，因此极端酶在食品工业中显示出了极大优势。综述了嗜热酶、嗜冷酶等极端酶的研究进展，主要从结构生物学的角度阐明了其耐热、耐冷等适应机制，并对其在食品工业中的应用现状进行了详细阐述。

食品酶；极端酶；食品加工；晶体结构

2017年初，国家发展和改革委员会、工业和信息化部关于促进食品工业健康发展的指导意见（发改产业［2017］19号）中多次强调要“绿色制造”、“提升科技创新能力”、“促进食品工业发生质的转变”。酶作为“绿色制造”的核心工具，在推动食品工业发展中扮演着至关重要的角色。

酶是一类具有高催化效率、高专一性、高多样性、反应条件温和的生物催化剂，除了具有催化活性的RNA（核酶）之外，几乎均为蛋白质。自1833年Payen和Persoz从麦芽的水抽提物中首次发现淀粉酶以来[1]，已发现4000多种酶，但实现工业化生产的仅60多种。 Dewan在2014年发布的全球工业酶市场研究报告中指出，在未来5年中，工业酶制剂市场将以8%的速度增长，到2018年将达到71亿美元[2]。诺维信公司作为该领域的龙头老大，占据了全球近一半（2016年为48%）的市场，其中食品酶在其整个销售额中的占比超过1/4（2016年为26%）。食品工业广泛使用的酶有20多种，主要为果胶酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、蛋白酶、脂肪酶等，普通酶在高温、高压、高渗、强酸、强碱等常用食品加工条件下非常不稳定、易失活，因此，开发可应用在极端条件下仍能保持高活力、高稳定性的酶——极端酶，对促进食品工业的绿色化发展尤为迫切与重要。

1 极端酶的分类及其基本性质

极端酶由极端微生物产生。极端微生物目前主要发现于古生菌和细菌领域，极端微生物可以在包括温泉或高温带的高温条件、冰川或深海的低温条件、工业或矿上废水的酸碱pH条件、盐湖中的高盐浓度条件、高放射性条件和极度干燥的沙漠条件下生长和繁殖。极端微生物进化并适应了环境，通过发展出独特复杂的机制来维持它们细胞组成的稳定和活性。通常情况下，极端微生物生产的酶可以耐受极端条件。

食品工业中广泛应用的极端酶主要分为嗜热酶、嗜冷酶、嗜压酶、嗜盐酶、嗜酸酶、嗜碱酶等[3]。其中，嗜热酶和嗜冷酶的应用较多，也是以下讨论的重点。

1.1 嗜热酶的基本性质

嗜热微生物是研究的最为广泛的极端微生物之一，可以在55～121℃稳定生存[4]。已从嗜热微生物中鉴定出大量嗜热酶，如纤维素酶、淀粉酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、植酸酶。嗜热酶的耐受温度通常在55～80℃，极端嗜热酶的耐受温度可达80～113℃。

1.2 嗜冷酶的基本性质

地球上有超过3/4的区域处于低温环境，地球上大部分的生物质都是在5℃以下生成的[5]。嗜冷微生物通常生存在-2～20℃。从嗜冷微生物中分离、鉴定到的嗜冷酶在常温下不稳定、易失活。

1.3 嗜压酶的基本性质

嗜压菌指在流体净力压大于40MPa的高水压下仍能正常生活的细菌，多存在于深海环境中[6]。在高压条件下，溶剂黏度降低、底物的溶解度增加，有利于提高传质速度和反应速度。因此，嗜压酶在工业应用中展现了良好的应用前景，但迄今为止，关于嗜压酶的理论研究相对较少，有待深入阐述。

1.4 嗜盐酶的基本性质

嗜盐微生物可以在高盐环境下生存，根据盐浓度不同，可分为三类：极端嗜盐菌（2.5～5.2mol/L NaCl）、温和嗜盐菌（0.5～2.5mol/L NaCl）和轻度嗜盐菌（0.2～0.5mol/L NaCl）[7]。通常情况下，嗜盐菌指的是极端嗜盐菌。与普通酶相比，嗜盐酶中含有更高比例的酸性氨基酸（丝氨酸、苏氨酸等），尤其在酶的表面，有利于结合大量水合离子，进而减少表面疏水性，防止聚集沉淀。

1.5 嗜酸酶和嗜碱酶

嗜酸微生物通常生长在pH4以下的环境中，嗜酸酶中含有的酸性氨基酸较多[8]；而嗜碱微生物主要生活在pH9以上的环境中，嗜碱酶中的碱性氨基酸含量相对较高。

2 极端酶的结构特点和适应机理

极端酶是极端微生物为适应极端环境而在细胞内形成的、具有特殊环境适应能力的酶。它们利用某些特殊的机制，能在极端环境中保持蛋白折叠和催化活性的稳定，这可能与其氨基酸序列上的进化相关，这些改变会影响酶的结构、柔性、带电性或疏水性，没有特定的趋势[9]。

2.1 嗜热酶的结构特点和适应机理

与嗜常温酶和其他蛋白相比，嗜热酶在氨基酸序列和结构上都有一些明显的变化。①氨基酸组成差异。将在105℃生长的Pyrococcus furiosus中的嗜热谷氨酸脱氢酶与嗜常温酶比较发现，其具有更高含量的疏水氨基酸，但极性氨基酸和带电氨基酸含量下降，甘氨酸残基数量也有所减少（图1）。②疏水核心更加致密。蛋白的稳定性依赖于小的非共价力，这些疏水相互作用的高度协作对提高蛋白的稳定性非常重要，因此，高度致密堆积的疏水核心结构，减少了疏水核心与溶剂的相互作用，起到了较好的稳定作用。③化学键增加。嗜热酶内部具有更多的氢键、二硫键、疏水相互作用等[10]，以维持其在高温条件下的结构稳定，通常来说，这些键的数量与酶的稳定性成正比。④蛋白比表面积下降。蛋白表面区域比例相较于蛋白体积大小的下降，有助于减少其与溶剂的接触，提高稳定性[11-13]。极端嗜热蛋白的结构与相对应的嗜常温蛋白的结构更保守，这表明这些保守残基在功能上的重要性。最大的不同是在蛋白与溶剂相互作用的区域，包括α螺旋、β折叠的大小差压和末端的离子修饰等[13-14]。整体来看，极端嗜热蛋白的结构堆积更加紧密，但并没有改变其最终的三维构象。

2.2 嗜冷酶的结构特点和适应机理

图1 Pyrococcus furiosus中的嗜热谷氨酸脱氢酶（Pf GluDH）与Clostridium symbiosum中的嗜常温谷氨酸脱氢酶（Cs GluDH）结构比较示意图

图2 Pseudoalteromonas haloplanktis中的嗜冷α-淀粉酶（AHA）与其同源的嗜常温α-淀粉酶（PPA）结构比较示意图

相较于嗜热酶和嗜常温酶，嗜冷酶有更柔软的结构，使它们在低温条件下也能保持较高的催化活力[15]。这些适应性与特殊的遗传变化相关，是长期选择进化的结果（图2）。嗜冷酶有如下结构特点：①结构核心区域疏水性降低，但表面疏水性增加；②氨基酸组成改变，如更低的精氨酸/赖氨酸比例，更多的甘氨酸，在环状区有较少的脯氨酸，而在α螺旋区有丰富的脯氨酸，蛋白表面有较多的非极性残基；③较弱的蛋白相互作用，如结构域之间和亚基之间的相互作用，较少的二硫键、氢键和其他静电相互作用，及较少的金属结合位点；④较少的二级结构和寡聚，但环状结构的数量和长度增加；⑤未折叠蛋白的构象熵值增加[16-17]。由于这些结构上的特点，温度降低时，嗜冷酶的反应速率相对中性和嗜热酶下降的更缓慢[18]。Collins等[19]比较了嗜冷和嗜常温木聚糖酶，证明嗜冷酶在低温时活力更高，但温度上升时不耐热。

3 极端酶在食品工业中的应用现状

几百年来，酶在食品和饮料中被广泛应用。在乳品业中，酶被用于乳酪的生产和乳制品的制备；在烘焙业中，酶可以提升面包的品质；在饮料业，酶用于维持酒的颜色和透明度，并减少硫含量。一些工业酶可以用于增加过滤性和提高产品风味。食品和饮料用酶构成了工业用酶的最大市场。但在应用过程中，尤其是在高温（如烘焙、烘干等）、低温（如低温发酵、果汁澄清等）、高压（如研磨、挤压等）、高渗（如盐渍、糖渍等）、强酸、强碱等较为苛刻的加工条件时，酶通常会出现不稳定、活力低，甚至失活的现象[12，20-21]。因此，极端酶在食品加工领域备受青睐（表1）。

3.1 嗜热酶在食品工业中的应用

3.1.1 嗜热淀粉酶

自1973年以来，淀粉加工工业逐渐成为酶的最大销售市场。酶法水解淀粉通过液化、糖化和异构化过程形成糖浆。淀粉水解的产物，如葡萄糖、麦芽糖和寡糖可用于生产多种非食品类产品，包括酒精、多元醇、抗坏血酸、赖氨酸等。在制作糖浆时，液化和糖化都是在60～70℃的高温下进行[27]。α-淀粉酶可在液化过程中催化淀粉形成麦芽糊精和麦芽浆。诺维信公司Avantec®、Termamyl®SC和Liquozyme®产品催化淀粉液化，使其更适于发酵，进而提高产量、降低成本。在糖化过程中，支链淀粉酶和葡糖淀粉酶（诺维信公司的Spirizyme®）可在70℃条件下，利用液化产物进一步产生糖。这些极端嗜热酶可实现淀粉最大程度的转化，并且能在各种麦芽浆和生产条件下持续发酵。支链淀粉酶和葡糖淀粉酶可以用于生产葡萄糖糖浆，支链淀粉酶和β-淀粉酶可用来生产麦芽糖糖浆。由Verenium公司研发和推广的嗜热α-淀粉酶Fuelzyme®，在88～91℃时发挥作用，可有效降低淀粉在低pH条件下液化时的麦芽浆黏度。通常，从极端嗜热菌中分离的酶的最适温度是80～110℃，pH是4.0～7.5，与淀粉液化的最优工艺吻合（100℃和pH4.0～5.0）[28]。因此，新的极端嗜热酶的特性研发对于工业应用至关重要。

表1 用于食品工业的商业化极端嗜热、冷酶[4，22-26]

嗜热淀粉酶在食品加工中也有应用，如烘焙、酿酒、易消化食品制造和蛋糕及果汁生产等[29]。诺维信公司的Novamyl®是一种嗜热脂肪芽孢杆菌中的热稳定麦芽糖淀粉酶，在烘焙业中广泛使用，用于提高面包品质等；AlphaStar PLUS是一种来自于枯草芽孢杆菌的食品级别的α-淀粉酶，是一种内切淀粉酶，能随机水解淀粉α-D-（1→4）糖苷键，从而快速降低凝胶淀粉的黏度，并在90℃时仍保持活性稳定，广泛应用于酿 酒业；Dyadic公司的GlucoStar PLUS是一种来源于曲霉菌的支链淀粉酶，可作为加工助剂，用于水解淀粉、直链淀粉、支链淀粉及水解产物的糊精化。此外，Dyadic公司还开发了一系列用于酿造业的嗜热酶。

3.1.2 嗜热葡萄糖异构酶

葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构为果糖，可用于制备果糖类糖浆。在60～90℃高温时，葡萄糖到果糖的转化率改变。诺维信公司的固定化鼠灰链霉菌中的葡萄糖异构酶Sweetzyme®，可以在55～60℃发挥作用。由新阿波罗栖热孢菌、海栖热孢菌、热栖水生菌和嗜热细菌来源的木糖异构酶也已经被鉴定和表征[30]，但还没有被商业化利用。最近有报道指出，从土壤中分离出的闪烁杆菌属和芽孢杆菌属的嗜热葡萄糖异构酶的最适温度达70℃，表现出在工业应用中巨大的潜力。

3.1.3 嗜热木聚糖酶

诺维信公司的Panzea BG和Panzea 10X BG，是地衣芽孢杆菌来源的嗜热木聚糖酶，主要用于烘焙行业。这些酶用于大规模生产构造和外观良好的面团。诺维信公司生产的用于食品工业的极端嗜热酶还包括：Fungamyl®（α-淀粉酶），可用于提高面包的色泽和体积；Lipopan®（脂肪酶）和Pentopan®（木聚糖酶），用来加强面团的硬度；Gluzym®（葡萄糖氧化酶），用来获得更强韧的面筋。

3.2 嗜冷酶在食品工业中的应用

低温加工有利于保持食物品质、减少风味物质挥发、减少副反应发生、降低能耗等，在食品加工中的应用越来越多。嗜冷酶可在低温下催化酶促反应高效进行，经温和的热处理即可使酶灭活，简化了加工工艺，并有效提高了产品品质。目前食品和饮料工业的趋势是用低温加工代替高温加工，低温加工可以提高经济效益、降低环境污染、节约能源，并且可以预防污染和损坏，避免在高温时不良化学反应的发生，因此，许多嗜冷酶被用于食品和饮料市场。

3.2.1 嗜冷淀粉酶

淀粉酶可水解多种食物中的淀粉成分，广泛应用于啤酒和葡萄酒发酵、面包制作和果汁加工等行业。以前在上述工业中使用的多为嗜热淀粉酶，近年来，嗜冷酶因其独特优势受到了越来越多的关注和使用。自从第一个嗜冷α-淀粉酶从南极菌——交替单胞菌中分离、鉴定、并在嗜常温的宿主大肠杆菌中被成功表达以来，研究人 员陆续从Gangotri冰川中的棒状杆菌GA2以及海洋细菌Z. profunda中分离出多种嗜冷α-淀粉酶，这些酶在食品加工领域展现了潜在的应用价值。诺维信也在嗜冷淀粉酶方面做了诸多技术及产品储备。

3.2.2 嗜冷β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶可以把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，用于生产无乳糖产品，在干酪乳清生物降解、甜味剂生产等领域使用广泛，具有较高的应用价值。有报道指出，一些商业化的食品级β-半乳糖苷酶，可在冷藏温度下使牛奶发挥足够的活力来使乳糖水解[31]。新型嗜冷β-半乳糖苷酶能简化和减少制造无乳糖产品的工艺并降低成本。从海洋嗜冷菌中分离出的β-半乳糖苷酶在pH6.5、20℃条件时能够水解80%的乳糖[32]；2012年，Sto ugaard和Schmidt申请了一种嗜冷β-半乳糖苷酶的专利，其在小于8℃时仍有稳定的酶活[33]；2014年，Voorde等[34]的研究指出，南极海洋细菌P. haloplanktis中的嗜冷β-半乳糖苷酶在低温条件下能较好地水解乳清蛋白，这为乳清蛋白在低温条件的水解及以此为原料进行的高附加值产品精深加工（如塔格糖）奠定了基础。

3.2.3 嗜冷果胶酶

果胶酶可以催化植物果胶降解，使果汁澄清、黏度降低，广泛用于葡萄酒酿造、天然油提取、果汁加工等食品工业[35]。目前，大多数商业化的果胶酶都是从嗜常温的菌种中获得的，没有划分耐低温的酶类。但是，部分果胶酶产品在低温有活性，如诺维信的一种果胶甲基酯酶、Biocatalysts公司的果胶酶62L（为聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的混合物），其中，果胶酶62L在10～60℃都具有活力。加拿大Lallemand公司生产的Lallzyme®是一种黑曲霉中果胶酶的混合物（聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶和果胶裂解 酶），在5～20℃下有活力，可以用于果汁和葡萄酒的澄清。

3.2.4 嗜冷木聚糖酶

木聚糖酶可以分解半纤维素为可溶的糖，在面包加工中可使面包松软。该过程发生在烘焙面包之前，温度更适合嗜冷的木聚糖酶的转化。P. haloplanktis TAH3A、 Flavobacterium sp. MSY-2和一株不知名细菌中的三种嗜冷木聚糖酶能有效改善面包的品质。但目前关于嗜冷木聚糖酶的研究仍很少，具有潜在的研究与应用价值[36]。

4 总结与展望

极端酶能较好地适应冷、热、酸、碱等极端环境，在工业应用中已展现出明显优势。迄今为止，各国研究者和酶制剂公司都对极端酶展开了广泛而深入的研究，并取得了很大进展，但实际可应用的极端微生物催化酶和微生物的数量仍很有限。为促进该领域的发展，需要在如下方面进 行创新与突破。

①方法创新。极端微生物和极端酶更需要在非标准条件下进行理论和应用研究，因此，亟待创新和发展新的理论和技术等。许多目前使用的经典微生物和生物化学实验工具不能用在极端微生物的研究中，因为它们不具备化学或机械属性来经受极端的条件。同样，研究普通微生物的技术需要进一步地调整以满足极端微生物的需求。此外，从在实验室条件下生产一种酶到获得最终商业化的产品之间存在很大的技术鸿沟，这仍是阻滞新型生物催化剂开发的巨大难题。希望通过科研人员和产业界的共同努力，逐一攻克技术难题，最大限度地实现极端酶在工业中的应用。

②技术突破。大自然提供了大量的生物催化剂来源。然而，为一种特殊的应用找到合适的酶制剂仍非常困难。新酶筛选及酶活力分析依赖于高效的、精准的方法和技术，如宏基因组筛选、基因组挖掘及通过功能筛选直接开发极端酶等[3]。但不同的酶基因挖掘方法中仍存在着诸多技术瓶颈，如突破难培养微生物的培养技术、高质量的DNA提取技术、极端微生物的裂解技术等。技术瓶颈不仅存在于新酶挖掘过程中，也存在于酶的改造及工业化应用等方面。直接培养极端微生物用来生产极端酶存在诸多局限性，目前使用的策略是在嗜常温的宿主中克隆和表达编码产品的基因，产 生高活力的和温度稳定的酶，如热链状芽孢杆菌中表达嗜热碱脂肪酶[37]。然而，在大肠杆菌和其他宿主中重组表达极端嗜热酶仍会导致基因错译等[38]。因此，新的培养宿主和分子工具的开发、新的基因和蛋白编辑技术的应用将极大推动极端酶的研究和在不同工业中的应用。

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Research progress of extremozymes and its application in food industry

LIU Xin，WEI Xue，WANG Fengzhong，XIN Fengjiao
Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

Enzyme is an efficient biocatalyst, which is widely used in food, textile, feed, medicine, energy and other fields, because of its mild reaction conditions, low energy consumption, strong substrate specificity and environmental protection. With the rapid development of the food industry, the demand for bio-manufacturing of food industry increases dramatically, and the share of food enzymes in the whole enzyme preparation market is also increasing. Most of the food processing processes involve high temperature, high pressure and other stricter conditions, so the extremozymes show outstanding advantages in the food industry. This paper reviews the research progress of extremozymes, expecially their adaption mechanisms from the perspective of structural biology and their applications in the food industry, especially thermophilic enzymes and psychrophilic enzymes.

food enzymes; extremozymes; food processing; crystal structure

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.04.009

刘欣，助理研究员，研究方向：生物酶研究与应用。E-mail：liuxin_023@163.com

魏雪，在读硕士，研究方向：生物酶研究与应用。E-mail：weixue 15701202366@163.com

王凤忠，研究员，研究方向：功能食品与生物活性物质。E-mail：wangfengzhong@sina.com

国家重点研发计划重点专项（2017YFD0400200）；国家自然科学基金面上项目（31571963）