工业生物过程高效转化与系统集成

谭天伟，秦培勇

北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029

工业生物过程高效转化与系统集成

谭天伟，秦培勇

北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029

工业生物技术已经成为世界各国的重要战略研究方向之一，但我国工业生物过程还存在低效、高能耗和高排放问题。因此，工业生物技术的过程科学研究还亟需解决复杂生物原料高效/定向转化机制、工业生物过程物质/能量流耦合规律、工业生物过程强化和系统集成原理3大关键科学问题。就“973”项目“工业生物过程高效转化与系统集成的科学基础研究”中3大关键科学问题方面的主要研究进展进行了论述。

工业生物技术；过程科学；过程集成

工业生物技术是以生物学、化学和化学工程学等学科为基础、以生物催化和生物转化为核心，研究大规模生产化学品、医药、能源和材料的新过程和新方法的学科，是以可再生生物质资源为原料的、环境友好的新型物质加工模式，是化学工程和生物技术有机结合的新制造技术的典范[1]。随着能源、资源、环境问题的日趋严峻，工业生物技术已经成为世界各国的战略研究方向。

我国在工业生物过程优化和系统集成研究方面与国外差距较大，具体表现在原料利用率和产品回收率低、能量消耗高，发酵工业排放COD（化学需氧量）占全国工业COD总排放量的19%。主要原因是工业生物过程是一个具有生命特征的动态复杂系统，目前对多变、复杂生物原料的定向/高效转化机制还不十分清楚，导致生物转化体系效率低、副产物多、COD排放高；产物浓度低，导致分离精制能耗高、收率低；生物过程子系统中物质流和能量流的割裂设计，以及对整个工业生物过程缺乏系统科学研究，导致整个系统高能耗、高物耗、高排放、整体经济性差。

针对上述问题，国内工业生物技术主要优势单位包括北京化工大学、天津大学、江南大学、中国科学院过程工程研究所、清华大学、华东理工大学、南京工业大学、中国科学院天津工业生物技术研究所等于2013年联合承担了“973”项目“工业生物过程高效转化与系统集成的科学基础研究”，经过几年的联合攻关，在生物原料高效/定向转化机制、工业生物过程物质/能量流耦合规律、工业生物过程强化和系统集成原理3个关键基本科学问题研究方面取得一定的成就；探究出如何实现复杂生物原料高效与定向转化，过程强化和系统集成，为实现工业生物全流程“吃得净、吃得快、排的少”奠定方法基础（图1）。

图1 工业生物过程系统集成策略

1 生物原料高效转化是可持续发展的重要发展方向

目前，我国非粮生物质资源丰富，其高效转化与利用具有巨大的发展空间[2-3]。但生物质原料成分复杂，可能含有有毒代谢物和重金属离子对目标微生物产生外界压力，而微生物细胞在受到外界压力和危险时能够立即采取“应激”行为，因此需要对微生物高效转化及胞内/胞外代谢“应激”机制进行解析。

天津大学等单位针对劣质生物原料中存在多种抑制剂的问题，研究了酿酒酵母菌株对复合抑制剂的“应激”机制[4]；发现纤维素转化过程中会有多种抑制剂产生[5-7]，解析复合抑制剂的耐受机制对纤维素高效生物转化具有重要的意义。国际上，美国农业部研究中心和苏黎世理工大学也在这方面展开研究。国外单位主要是针对单一抑制剂成分的抑制机理进行解析。天津大学从实际生产过程出发，解析水解液中复合抑制剂的耐受机制，选育了复合抑制剂耐受菌株菌种，建立了酿酒酵母对抑制剂的耐受能力快速提升策略[8]；获得了针对纤维素水解液中抑制剂的典型代表（1.3g/L糠醛、1.5g/L苯酚和5.3g/L乙酸的混合物）的耐受菌株，在抑制剂存在下发酵周期由141h缩短到21h[8-9]，申请了中国发明专利（CN201110238038.90）；发现了新的抑制剂耐受机制，通过解析抑制剂耐受菌株和原始菌株的差异，以及菌株对抑制剂的响应，建立了酿酒酵母耐受抑制剂的机理模型[10-12]；发现了肌醇和脯氨酸是与菌株耐受性相关的重要代谢物，通过降低和提高肌醇和脯氨酸的含量可以显著降低和提升菌株的复合抑制剂耐受能力，并同时发现了活性氧是脯氨酸调控菌株耐受能力的关键中介[9]。

总之，在复杂生物原料体系中系统研究胞内/胞外代谢物互补调控的规律，有助于提高微生物对生物质的转化效率、减少污染、降低成本。突破传统利用优质生物原料制备单一产品的模式，实现劣质生物质原料的高效和充分利用及产出的利益最大化。

2 物质/能量流高效利用是提高工业生物过程转化效率的重要途径

传统提高目标产物生产效率的主要方法是强化微生物胞内代谢网络。事实上，若只对物质代谢网络进行强化，结果常常不尽人意。造成该现象的主要原因之一是微生物胞内能量因子（如ATP、NADH和NADPH等）与物质流代谢不匹配。微生物胞内物质代谢网络实质是由伴随能量因子转化与再生的氧化/还原反应等体系组成；近年研究结果表明，生物基化学品的合成途径都涉及ATP、NADH及NADPH等能量因子[13]，如何实现微生物细胞内物质/能量流的高效匹配，对复杂生物原料的高效和定向转化具有重要的意义。

江南大学等单位针对细胞内酮酸发酵过程的物质和能量集成原理及关键技术等方面进行了大量研究。通过对α-酮戊二酸生产菌株Y. lipolytica WSH-Z06进行全基因组测序和分析得到6条多功能的酮酸转运蛋白，从酮酸转运机制层面揭示了其积累α-酮戊二酸的机制[14]。基于Y. lipolytica WSH-Z06发酵生产 α-酮戊二酸过程的特点，建立了一种高通量筛选方法，快速实现了α-酮戊二酸高产菌株的筛选[15]。应用比较基因组学分析α-酮戊二酸产量突变菌株与野生菌株之间的差异，揭示了与α-酮戊二酸代谢途径相关的控制线粒体合成、调控能量代谢和调控氨基酸和酮酸转化等基因对α-酮戊二酸的积累的影响[16]。基于α-酮戊二酸代谢调控机制解析，采用工业育种与高通量筛选技术相结合的方法，使α-酮戊二酸转化率达到50.57%。该技术已在5家国内企业实施，近三年累计新增产值6.21亿元，利税2.43亿元，出口创汇1902万美元。酮酸发酵法制备关键技术及产业化获得2015年国家技术发明二等奖。

在宏观层次上，工业生物过程与工艺的物质/能量协同作用是生物原料高效转化的另一个关键。北京化工大学通过把体现工业生物过程特性的物质和能量传递规律与耦合控制原理相结合，以“原料-转化-分离-废物资源化利用”一体化为优化主导思想，研究胞外工艺过程中的物质流与能量流的匹配规律，对中粮丰原生化燃料乙醇精馏工段进行了设计和改造[17]。利用携带高品位能量（如高温）而又需要冷却的物质流和需要加热的低品位能量物质流进行非接触式能量交换, 达到加热和冷却耦合的目的；精馏塔系统由粗塔、精塔和二精塔等组成，塔顶蒸汽采用不同的压强梯度，高压强的塔顶蒸汽与相邻精馏塔再沸器进行热交换并作为热源，即利用二精塔的塔顶蒸汽给精塔再沸器加热，精塔塔顶蒸汽给粗塔再沸器加热。形成了原料利用合理化、过程能耗最低化、废物排放和环境污染最小化的生物过程优化控制和系统优化方法。产量由原来的6万吨/年提升到了11.6万吨/年，蒸汽由原来的2.2吨蒸汽/吨酒精降低到1.5吨蒸汽/吨酒精，年节约冷却水402万吨，2015年新增经济效益1298万元。

南京工业大学等单位在聚氨基酸工业生物过程的系统优化原理与调控规律方面进行了深入的研究。针对因聚氨基酸生物合成机理信息缺乏导致的合成效率低下的瓶颈，项目组在世界范围内率先对ε-PL（ε-聚赖氨酸）生产菌S. albulus PD-1的全基因组进行测序（GenBank No：AXDB00000000），结合中间代谢产物与关键酶活力检测技术完善了S. albulus PD-1的代谢网络[18]。首次在S. albulus PD-1代谢产物中发现另一种新型的聚氨基酸——聚二氨基丙酸（PDAP），并通过加入小分子代谢调节剂，实现了ε-PL和PDAP的可控联产，研究发现柠檬酸对ε-PL和PDAP的共生有明显调控作用，柠檬酸的添加使得ε-PL合成途径的流量显著增加，胞内还原力水平提高，有利于ε-PL的合成[19]。ε-PL发酵时间由120h缩短至80h，比国际最高水平的日本窒素公司耗时少近一半[20]。聚谷氨酸作为生物高分子，伴随着产物积累，体系变得十分黏稠，针对营养物质传质困难的问题，采用放射性14C同位素示踪技术系统研究了菌株中底物跨膜运输的机理，并针对菌株生长与底物转运两者最佳pH的不一致，创造性地采用了pH分步调控策略，提高菌体吸收营养的能力，使底物转化率达到90.5%的国际最高水平[21]。在以上理论发现和技术创新的基础上，实现了生物法制备聚氨基酸高效低成本的系统优化。该研究获得了2014年国家技术发明二等奖。

总之，要充分考虑“原料-反应-分离-废物排放一体化”，进行整个工业生物过程从胞内到胞外的物质和能量匹配设计，实现物料流和能量流在整个工业生物过程中的合理分配、副产物和目标产物的优化调控、废渣废水的最优利用等。

3 过程强化与系统集成是工业生物技术增效降耗、节能减排的重要手段

过程强化已成为过程工业重要的前沿发展方向。过程强化可显著提升工业生物过程的转化效率。因此，探究工业生物过程“三传一反”协同作用机制，对工业生物过程节能降耗具有重要的意义。

清华大学等单位在从丙烯腈生产丙烯酰胺的过程强化方面进行了大量的研究。日本和中国分别在1985年和1994年以野生红球菌和野生诺卡氏菌为生物催化剂实现了丙烯酰胺的产业化。但在工业生产过程中一直存在细胞和胞内酶的抗逆性差以及副产物积累问题，导致原料单耗增加、分离纯化成本提高、反应效率下降、能耗高以及废水排放多。清华大学从细胞催化剂性能和过程工艺两个层面进行能质耦合强化和反应过程强化改造，使生物催化剂在工业环境中高效稳定运行。

发展了热不对称PCR耦合反向PCR染色体步移技术；建立了红球菌转座体随机敲除、单基因定点敲除以及双基因叠加敲除的方法；利用同源单交换重组，成功敲除了腈代谢酶系中主导副产物生成的酰胺酶基因，获得了低副产物基因工程红球菌TH3（ZL200880000969.1）[22]。该红球菌染色体酰胺酶基因敲除方法，通过了PCT国际专利新颖性、创造性和工业实用性审查（WO2009/117843），并被授予美国发明专利（US8518685）。构建的基因工程红球菌TH3已成功用于丙烯酰胺产业化，解决了生产过程中副产物积累、原料损耗问题，游离细胞催化水合副产物量<0.07%，下降70%～80%，精制离子交换过柱量提高了55%，废水排放下降30%，每年减少9万吨以上废水排放量，发酵原料成本下降40%，丙烯腈单耗从0.80～0.82kg/kg丙烯酰胺下降为0.76kg/kg丙烯酰胺，接近理论值0.75kg/kg丙烯酰胺。自2009年8月实现产业化应用到2013年年底，TH3菌株新增利润2.68亿元，上交税金1.50亿元，创收外汇925万美元，节支1580万元，经济和社会效益显著。

开发了游离细胞催化耦合中空纤维超滤膜分离新工艺[23]。解决了原固定化细胞工艺中酶活损失大、杂质含量高的问题，菌体利用率提高60%～70%，水合产物杂蛋白降低到5×10-4%以下，游离细胞使用批次从3～5批提高到6～10批，并在年产5万吨规模丙烯酰胺工业生产中稳定高效运行，被授予中国发明专利ZL03109806.1。

以产重组腈水合酶的基因工程红球菌游离细胞为催化剂的丙烯酰胺生产工艺实现了高效、低耗（能耗/物耗）、低成本、低排放的全局过程优化，获得2016年东营市科学技术合作奖及2013年中国石油和化学工业联合会技术发明二等奖。

再者，工业生物过程是一个上中下游多过程集成系统，虽已对各单元过程进行了大量的优化研究，但还缺乏单元子系统之间集成与优化研究，因此工业生物过程效率仍较低、三废排放高，造成一定环境问题。

华东理工大学等单位在工业生物过程集成和系统优化方面做了大量的工作。将用于描述质量与能量集成和耦合的模型与反应器流场模拟相结合，建立了一种基于过程流场时空特征的动力学数值模拟框架[24]。该数值模拟框架由两部分整合而成，其一，微生物细胞响应外界环境时序改变的动力学数值模拟；其二，通气搅拌生物反应器中的气液两相流模拟，以及微生物细胞在反应器流场气液固三相中的流动轨迹模拟。通过模拟，不仅能够实现对生物反应器内环境不均一度（底物、溶解氧、前体、菌体等）的数值模拟，更可以基于不同微生物的历史经历对其在不同位置的性能（比产物合成速率、比菌体生长速率、比底物消耗速率、比氧消耗速率等）进行评估。利用模拟结果更易于针对性地就特定设备和反应条件的问题提出解决方案，进行理性优化和放大。这一数值模拟框架已被成功用于青霉素好氧发酵过程和红花植物细胞培养的研究[25]。以120m3生物反应器中的青霉素发酵过程为对象，利用该动力学数值模拟框架对100万个独立颗粒（微生物簇）进行演算，获得了独立颗粒对流场时空特性响应的物质能量代谢特征[26]。

在大规模复杂工业生物过程的快速高效多目标优化算法方面，经过系统分析目前各类智能优化算法的性能和特点，以局部和全局寻优性能兼备的差分进化算法为基础，进行适用于大规模复杂工业生物过程的快速高效多目标优化算法的研发，先后提出参数自适应的多目标差分进化算法（PBMODE）、变异策略和参数共同自适应的多目标差分进化算法（APBMODE）[27]，并应用于发酵过程多目标优化问题的求解，以基于广义计量反应方程和幂级数结构的发酵动力学模型为基础[28-29]，分别构建产物最大化、底物转化率最大化两个优化目标，以初始菌体浓度、初始底物浓度、实时溶氧比为优化变量，进行寻优，获得最佳的优化结果。

上述理论已被成功用于工业化生产，在宜都东阳光、北方药业、维尔康、山东福洋等企业，实现了青霉素、红霉素、维生素B12、庆大霉素C1a等多个产品从实验室规模到工业化规模的放大，产量提高20%以上。2015～2016年实现产值11亿余元。

总之，工业生物过程系统的整体效率受制于系统内各单元的优化与系统集成，其中某一过程或层次常常为该系统的限速步骤。因此需要采用系统工程研究方法确定关键子系统并加以调控，实现整个工业生物系统的多目标集成与优化。

4 总结与展望

综观我国工业生物技术发展的现状与趋势，生物技术产业还缺乏集成创新和系统设计研究，造成复杂生物原料转化效率低、三废排放高等。因此，急需布局工业生物过程高效转化与系统集成研究。项目组致力于对生物原料高效/定向生物转化机制、工业生物技术微观（细胞）和宏观（过程）层次上的物质和能量耦合规律、过程系统集成与优化原理等关键科学问题进行深入研究，提出了基于胁迫因子响应和菌群协同效应的生物高效转化新机制以及基于物质流与能量流耦合的过程强化新思路，形成了一批具有一定国际影响力的成果，推动了我国工业生物技术在过程科学方面的研究。

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High efficient biotransformation and system integration in the process of industrial biotechnology

TAN Tianwei，QIN Peiyong

College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Industrial biotechnology has attracted more and more attention in the world. However, China is still faced with some problems about ineff cient biotransformation, high energy consumption and high emission problems in the process of industrial biotechnology. Therefore, it is necessary for industrial biotechnology to solve the key scientif c problems, including the mechanism of high eff cient and directional biotransformation, coupling rules of the energy/ mass, and bioprocess intensif cation and system integration, in the f eld of bioprocess science. This paper presented the important advances of the three key scientif c problems on bioprocess science in this 973 program.

industrial biotechnology; process science; process integration

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.04.003

谭天伟，博士，中国工程院院士，“973”项目首席科学家，北京化工大学校长。研究方向为生物化工。E-mail：twtan@ mail.buct.edu.cn

秦培勇，博士，教授，博士生导师，北京化工大学生命科学与技术学院副院长。研究方向为生物化工。E-mail：qinpy@mail.buct.edu.cn

国家“973”计划项目（2013CB733600）