MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎模型中的表达变化

王梦航李水静韩琳余力生

1北京大学国际医院耳鼻咽喉-头颈外科（北京102206）

2北京大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科（北京100044）

·基础研究·

MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎模型中的表达变化

王梦航1李水静1韩琳2余力生2

1北京大学国际医院耳鼻咽喉-头颈外科（北京102206）

2北京大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科（北京100044）

目的研究MUC5AC（黏蛋白MUC5AC）和TNF-α（肿瘤坏死因子-α）在大鼠中耳炎黏膜的表达变化。方法40只SD大鼠随机分为对照组10只、实验组30只；实验组建立大鼠急性分泌性中耳炎模型，采用qPCR检测MUC5AC及TNF-α在第1天,第3天,第7天两组中耳黏膜的表达变化，并用免疫组织化学染色技术分别检测MUC5AC和TNF-α在第1天,第3天,第7天在中耳黏膜的表达变化。结果在对照组中，MUC5AC不表达，TNF-α轻度表达，实验组从第1天到第3天MUC5AC及TNF-α的表达随着时间的延长而增强，至第7天则表达开始减弱，实验组与对照组的比较差别具有统计学意义（P<0.05）。结论MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜中表达上调，且与时间相关。

MUC5AC;TNF-α；急性分泌性中耳炎；中耳黏膜

Acknow ledgements This study was supported by the Twelfth-five-year"national science and technology support plan (2012BAI12B01),the National Natural Science Foundation of China(11202018),the Post-doctoral Foundation of China (20110490269,2013T60055)and Peking University InternationalHospitalResearch Fund(YN2016QN03).

Conflictof interestTheauthorsdeclareno conflictsof interest.

分泌性中耳炎(Otitismediawith effusion,OME)是耳科的常见病和多发病，主要特征为中耳积液及听力下降。调控中耳黏膜对炎症损伤反应的机制研究，正在成为我们的重要课题之一。MUC5AC是黏蛋白家族成员之一，是中耳黏液纤毛传输系统的重要组成部分，黏蛋白的表达增强可以影响中耳黏膜纤毛的运动功能[1]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症介质之一，它的启动与激活，在中耳炎的发病过程中起重要作用[2-3]。因此，本实验初步研究MUC5AC（黏蛋白MUC5AC）及TNF-α（肿瘤坏死因子-α）在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜的表达变化。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

主要试剂有引物合成序列测定(Qiagen),荧光定量PCR试剂盒(Invitrogen公司,CA,USA)，鼠抗人MUC5AC单克隆抗体以及配套使用的SP免疫组化试剂盒购自北京中山生物公司，鼠抗人TNF-α单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，细菌内毒素（Endotoxin,ET）购自Sigma公司(St Louis, MO,USA)。

1.2 实验动物及分组

选用雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，体重100-150g，由北京大学医学部实验动物中心供应。实验前所有大鼠耳廓反应灵敏，用手术显微镜观察双侧鼓膜正常。将筛选后的大鼠随机分组：对照组（正常组）：10只SD大鼠，不做任何处理，直接处死，取听泡标本。

实验组（Secretory otitismedia,SOM组）：内毒素（Endotoxin,ET）组30只[4-5]，均以右耳作为实验耳，中耳腔注射内毒素ET 40μl;左耳作为对比，用以比较观察内毒素注射大鼠右耳鼓膜像的变化情况。将注入后的大鼠随机分为3组，分别于1d,3d, 7d各处死10只。

1.3 动物模型的建立

2%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射，麻醉满意后，固定于小动物立体定位仪。剪开皮肤、皮下及骨膜，暴露听泡，以尖端接有玻璃微电极的微量注射器吸取准备好的内毒素ET液体或生理盐水NS 40μl，精确定位后垂直进针至定位刻度，刺入中耳腔，骨蜡封闭骨孔。缝合皮肤，麻醉清醒后正常食水饲养。大鼠急性分泌性中耳炎模型（SOM组）鼓膜像标准：处死大鼠前均用显微镜观察是否形成分泌性中耳炎，入选动物鼓膜像需为混浊内陷、膨出伴有积液者。

1.4 标本收集

先观察双侧鼓膜情况，然后断头取右侧听泡，置于4℃预冷的生理盐水中，解剖显微镜下除去筋膜、软组织等，将听泡在滤纸上吸水干燥，在解剖显微镜下剥离实验组大鼠中耳周围黏膜，置于冻存管，液氮-80℃冷藏保存。听泡4%多聚甲醛固定后行免疫组化染色。

1.5 定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测

大鼠中耳黏膜样本分离并均质化后，按照qP⁃CR试剂盒的说明进行操作。首先进行总RNA的提取及纯化，然后调整RNA模板体系，由RNA合成cDNA。最后配制体系进行PCR扩增，qPCR检测反复重复三次，以SPSS软件进行统计分析,数据结果分析以±s表示,以*P<0.05认为具有统计学意义。

1.6 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色采用SP法。MUC5AC及TNF-α单抗稀释，稀释倍数均为1：100，石蜡切片脱蜡、水化;3%H2O2去离子水孵育5～10min;切片滴加一抗(鼠抗人MUC5AC单克隆抗体及TNF-α单克隆抗体),37℃孵育2h,PBS洗片2min×3次;滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,37℃孵育20min,PBS洗片2min×3次;滴加DAB,光镜下观察,自来水冲洗;苏木素复染、脱水、透明、封片。阳性细胞结果判定：显微镜400或200倍镜下任选5个不同视野观察并计算阳性细胞着色深浅及百分率，按阳性细胞所占百分比计分，统计分析时（++）（+++）合计为阳性表达[6]。

1.7 统计学分析

数据统计采用统计软件SPSS 13.0进行统计学分析单向方差分析（ANOVA）以及Turkey’s test，且*P<0.05具有显著性差异。

2 结果

2.1 实验组及对照组中MUC5ACmRNA的表达情况

收集实验组（SOM组）及对照组中耳周围区域黏膜，提取RNA后行qPCR检测，具体方法同上。结果发现，MUC5ACmRNA表达量自内毒素刺激第1天后开始增加，至第3天达到最高，第7天减弱，呈现时间依赖性；所有数据与对照组相比，差异均有统计学意义（*P<0.05），表明内毒素刺激诱导的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中MUC5ACmRNA表达的上调，有时间依赖性（图1）。

图1 MUC5ACmRNA在大鼠中耳黏膜的相对表达量Fig.1 The expression of MUC5ACmRNA in themiddle ear mucosa of each group

2.2 实验组及对照组中TNF-αmRNA的表达情况

收集实验组（SOM组）及对照组中耳周围区域黏膜，提取RNA后行qPCR检测，具体方法同上。结果发现，TNF-αmRNA表达量自内毒素刺激第1天后开始增加，至第3天达到最高，第7天则表达减弱，呈现时间依赖性；所有数据与对照组相比，差异均有统计学意义（*P<0.05），表明内毒素刺激诱导的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中TNF-αmRNA表达上调，与时间相关（图2）。

图2 TNF-αmRNA在大鼠中耳黏膜的相对表达量Fig.2 The expression of TNF-αmRNA in them iddle earmucosaof each group

2.3 实验组及对照组MUC5AC免疫组化染色观察结果

黏蛋白MUC5AC免疫组化染色显示：实验组黏蛋白MUC5AC在鼓室黏膜上皮的杯状细胞、腺体细胞的包浆中阳性表达，表现为较均匀的棕黄色的细颗粒状（图3-Fig3B,3Cand 3D）；对照组的正常鼓室黏膜无明显MUC5AC表达（图3）。MUC5AC在实验组表达显著高于对照组，与对照组相比有显著性差异（*P<0.05）；实验组的中耳黏膜在第1d组开始阳性表达，3d组阳性表达最强，7d组开始减弱，MUC5AC表达具有时间依赖性（图5）。

2.4 实验组及对照组TNF-α免疫组化染色观察结果

TNF-α免疫组化染色显示：实验组（SOM组）肿瘤坏死因子TNF-α在鼓室黏膜上皮细胞、成纤维细胞等的包浆中阳性表达，表现为着色较深的棕黄色的颗粒状（图4）；对照组个别大鼠的正常鼓室黏膜有阳性的TNF-α表达（图3）。TNF-α在实验组表达显著高于对照组，与对照组相比有显著性差异（*P<0.05）；内毒素诱导的大鼠急性分泌性中耳炎模型实验组的中耳黏膜，在第1天，3天，TNF-α表达随时间依赖性增多，第7天表达明显减弱（图5）。

图3 黏蛋白MUC5AC在大鼠中耳黏膜的表达(SP×400)Fig.3 The expression of MUC5AC in them iddle earmucosa of each group(SP×400)

图4 肿瘤坏死因子TNF-α在大鼠中耳黏膜的表达(SP×200)Fig.4 Theexpression of TNF-αin themiddleearmucosaof each group(SP×200)

图5 黏蛋白MUC5AC和肿瘤坏死因子TNF-α在大鼠中耳黏膜表达的阳性率Fig.5 The positive rate of MUC5AC and TNF-αin the m iddleearmucosaof each group

3 讨论

分泌性中耳炎(otitismediawith effusion,OME)是耳科的常见疾病之一，以中耳积液及听力下降为主要临床特征，是一种小儿常见的中耳非化脓性疾病，与儿童的语言及智力发育密切相关[7]。应用内毒素造成大鼠急性分泌性中耳炎模型，快速、有效，是分泌性中耳炎的常见模型之一。

近年来，通过对中耳黏液纤毛传输系统的认识，中耳黏膜、中耳积液中的黏蛋白和细胞因子的表达，逐渐成为耳科分子生物学领域的一个研究热点[8]。黏液纤毛传输系统是由中耳黏膜及黏液毯组成，这一系统的主要成分是黏蛋白。至今已发现13种不同类型的黏蛋白(MUC1—4, MUC5AC,MUC5B,MUC6—12)。 其 中 ，MUC1、MUC4为跨膜型黏蛋白，MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8为分泌型黏蛋白。黏蛋白存在于黏膜表面，起着保护上皮和保持纤毛清除并防止病原体黏附的作用[9-10]。其中MUC5AC由杯状细胞分泌，是构成黏液毯的主要成分。然而MUC5AC在分泌性中耳炎的作用机理还未完全阐明。

细胞因子是指某些刺激因素作用下，由免疫细胞（单核巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞）和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞、纤维母细胞等)合成、分泌的一类生物活性物质。其中TNF-α对于炎症的重要作用，使得它与黏蛋白之间的关系探讨显得尤为重要。在分泌性中耳炎病程初期，中耳腔局部产生的TNF-α可以直接作用于中耳黏膜，造成黏膜水肿、通透性增强，破坏纤毛黏液传输系统的功能。并有体外实验研究表明：经TNF-α处理的鼠中耳黏膜上皮4小时后出现MGP(黏蛋白)分泌，并持续到24小时，而且具有时间和剂量依赖性[11-12]。然而TNF-α在分泌性中耳炎大鼠实验模型的作用机制及与黏蛋白的关系，还未完全明确。

本实验应用内毒素构造急性大鼠分泌性中耳炎模型，采用qPCR和免疫组化染色技术SP法测定MUC5AC和TNF-αmRNA和免疫组化染色中耳黏膜的表达情况。实验表明：内毒素诱导的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中MUC5AC及TNF-αmRNA表达上调，有时间依赖性。MUC5AC及TNF-α在中耳黏膜免疫组化染色表达上调，随时间延长而出现阳性表达改变。TNF-α可以刺激杯状细胞及成纤维细胞等分泌黏液，使病程慢性化，促进了分泌性中耳炎的发展和迁延不愈。本研究的结果初步证实了TNF-α与中耳黏膜的黏蛋白MUC5AC分泌有一定的关系。提示炎性细胞因子在黏蛋白基因的表达机制中起重要作用，然而何种通路调节黏蛋白基因表达仍有待进一步研究。

综上所述，MUC5AC及TNF-α表达于内毒素激发的急性分泌性大鼠中耳炎模型的中耳黏膜中，在分泌性中耳炎的发生过程可能发挥了重要作用，具体机制有待进一步研究。

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Expression ofMUC5AC and TNF-αin M iddle Ear M ucosa in a RatM odelofAcute OtitisM ediaW ith Effusion

WANGMenghang1,LeeSu Jeong1,Han Lin2,YU Lisheng2
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Peking University InternationalHospital,Peking University, Beijing,102206,China
2DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,People’sHospital，Peking University，Beijing 100044，China

YU Lisheng Email：yulish68@163.com

ObjectiveTo study expression of MUC5AC and TNF-αin them iddle earmucosa in ratmodelof acute otitismediaw ith effusion.M ethodsForty adult female Sprague-Daw lay(SD)ratswere random ly divided into a control group and aexperimentalgroup.Rats in the experimentalgroup

injection of endotoxin.The leveland pattern of MUC5AC and TNF-αexpression w ithin themiddle ear epithelium were tested by qPCR and immunohistochemical assays.ResultsqPCR and immunohistochemical staining results showed increased expression of MUC5AC and TNF-αin the experimentalgroup alongw ith time(*P<0.05)and theMUC5ACweremainly concentrated on the gobletcells.ConclusionsExpression ofMUC5AC and TNF-αis increased in ratmiddle ear epithelium w ith acutemedia otitisw ith effusion.Hence,it isspeculated thatMUC5AC and TNF-αmay participate in the processof acutemediaotitisw ith effusion.

MUC5AC;TNF-α;M iddle Ear Epithelium;AcuteMedia OtitisWith Effusion

R764

A

1672-2922（2017）03-329-5

2016-12-21审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.011

十二五国家科技支撑计划（2012BAI12B01），国家自然科学基金科学基金项目（11202018），中国博士后科学基金项目（20110490269,2013T60055），北京大学国际医院院内科研基金（YN2016QN03）。

王梦航，博士后，主治医师，研究方向:耳科临床及基础研究

余力生，Email:yulish68@163.com