龙牙百合鳞茎总黄酮提取工艺及抗氧化性研究

薛梅 周卫平

摘要[目的]探讨龙牙百合鳞茎总黄酮的最佳提取工艺，并研究其抗氧化活性。[方法]以龙牙百合鳞茎为研究对象，采用优化超声波法提取总黄酮。在单因素试验的基础上，采用正交试验法研究了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对总黄酮提取量的影响，并确定其最佳工艺条件，并对其体外抗氧化活性进行了研究。[结果]龙牙百合鳞茎总黄酮的最佳工艺条件如下：提取温度为30 ℃，乙醇浓度为80%，料液比（g ∶mL）为1∶10，提取时间为20 min。在此条件下，百合鳞茎总黄酮提取量为（32.236±0.513）mg/g。抗氧化试验结果表明，龙牙百合鳞茎总黄酮提取液对DPPH· 的清除效果优于相同浓度的维生素C溶液，且存在顯著差异（P<0.05）。[结论]该研究可为龙牙百合的综合开发与利用提供理论依据。

关键词 龙牙百合鳞茎；总黄酮；超声波法；抗氧化活性

中图分类号 S644.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0010-03

Abstract[Objective] To explore the optimum extraction technology of total flavonoids from Longya lilium bulb and study their antioxidant activity.[Method] Taking L.lilium bulb as research object，total flavonoids were extracted from L.lilium bulb by using optimized ultrasonic method.Based on single factor experiment，the effects of ethanol concentration，materialliquid ratio，extraction time and extraction temperature on the extraction quantity of total flavonoids from L.lilium bulb were studied and the optimum extraction technology was confirmed by using orthogonal experiment.And their antioxidant activities of total flavonoids in vitro were studied.[Result] The optimum extraction conditions of total flavonoids from L.lilium bulb were as follows：80% ethanol，solidliquid ratio of 1∶10 （g ∶mL），extraction temperature of 30 ℃，extraction time of 20 min.Under the optimum conditions，the extraction quantity of total flavonoids was （32.236±0.513） mg/g.The results of in vitro antioxidant test showed that the scavenging effects of total flavonoids extract from L.lilium bulb to DPPH· was better than that of vitamin C solution at the same concentration，and there was significant difference（P<0.05）.[Conclusion] The research can provide theoretical basis for the comprehensive exploration and utilization of L.lilium.

Key words Longya lilium bulb；Total flavonoids；Ultrasonic method；Antioxidant activity

龍牙百合（Lilium brownii var.viridulum）为多年生草本植物，是我国重要的经济型食用百合品种之一，主产于四川、湖南、重庆等地[1]。龙牙百合食用部分为鳞茎，且具有多种药效，营养价值很高，是卫生部首批公布的药食同源食品[2]。

黄酮类化合物又名生物类黄酮（Bioflavonoids），包括黄酮、异黄酮、黄烷酮、双黄酮及其甙类，具有广泛的生理活性，广泛存在于果蔬和中草药中。黄酮具有清除自由基、抗脂质过氧化、提升体内抗氧化水平的作用，此外还具有作为防治心脑血管疾病的天然药物和膳食补充剂开发的潜力[3]。

目前，关于植物黄酮提取工艺的研究已经涉及多种植物[4-7]，但关于龙牙百合鳞茎的研究还较少。笔者以龙牙百合鳞茎为研究对象，通过前期预试验对水浴、超声波、索式3种提取方法和乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取试剂进行筛选，确定以超声辅助为提取方法、乙醇为提取剂，通过单因素试验和正交试验筛选出龙牙百合鳞茎总黄酮的最佳提取工艺，并对其体外抗氧化活性进行了研究，旨在为龙牙百合的综合开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将龙牙百合鳞茎（购于重庆江津邱仁平百合种植基地）于60 ℃恒温烘干后粉碎过60目筛，密封冷藏待用。试验所用药品均为分析纯；芦丁标准品，HPLC≥98%，购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制。精密称取5.0 mg芦丁标准品置于25 mL容量瓶，加70%乙醇至刻度，摇匀，得到0.2 mg/mL芦丁溶液；精密量取0、1、2、3、4、5、6 mL 0.2 mg/mL芦丁溶液分别置于25 mL容量瓶中，各加水6 mL，再加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀放置15 min，以不加标准品的对照管为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度。以芦丁标准品的质量浓度（x）为横坐标，以吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程y=10.206x+0.007 5（R2=0.998 9）。

1.2.2 样品总黄酮的测定。称取百合鳞茎粉末2.5 g，经抽滤得到提取物，旋转蒸发后溶解定容。根据芦丁的标准曲线，计算出总黄酮含量。

1.2.3 总黄酮提取条件筛选的单因素试验。

1.2.3.1 超声温度的筛选。在料液比（百合鳞茎/乙醇溶液）为1∶40 （g ∶mL，下同）、乙醇浓度为70%、提取时间为30 min的条件下，比较不同提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响。

1.2.3.2 乙醇浓度的筛选。在料液比为1∶40、提取时间为30 min、提取温度为40 ℃的条件下，比較不同乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响。

1.2.3.3 料液比的筛选。在提取温度为40 ℃、乙醇浓度为80%、提取时间为30 min的条件下，比较不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响。

1.2.3.4 提取时间的筛选。在提取温度为40 ℃、乙醇浓度为80%、料液比为1∶20的条件下，比较不同提取时间（10、20、30、40、50 min）对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影響。

1.2.4 优化总黄酮提取条件的正交试验。根据单因素试验结果，选择提取温度（A）、乙醇浓度（B）、料液比（C）、提取时间（D）为考察因素，进行L9（34）正交试验，具体因素与水平设计见表1。通过测定总黄酮提取量，优选最佳提取工艺条件。

1.2.5 重复性试验。根据正交试验结果确定最佳提取方法和条件后，同时做5个平行样品，计算相对标准偏差（RSD）。

1.2.6 抗氧化性研究。根据正交试验得到的最优提取条件提取龙牙百合鳞茎总黄酮，按比例稀释成不同浓度的百合鳞茎总黄酮溶液，进行DPPH·清除能力试验。取稀释后不同浓度（5.0、6.2、8.4、12.5、25.0 μg/mL）的百合鳞茎提取液2 mL和0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，加入同一具塞试管中，摇匀后在室温下密闭静置30 min，以纯溶剂为参比，于517 nm波长处测定吸光度，计算龙牙百合鳞茎黄酮提取液对DPPH·的清除率。采用同样的方法，测定与百合鳞茎总黄酮溶液相同浓度梯度的维生素C溶液对DPPH·的清除率，作为对照。按照以下公式计算DPPH·清除率：DPPH·清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中，A1为加提取液后DPPH·溶液的吸光度，A2为提取液的吸光度，A0为未加提取液时DPPH溶液的吸光度。

1.3 数据处理 采用Excel 2003软件和SPSS 13.0统计软件对试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 提取温度对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响

从图1可以看出，在料液比为1∶40、乙醇浓度为70%、提取时间为30 min的条件下，当提取温度为40 ℃时，龙牙百合鳞茎的总黄酮提取量最高，与其他提取温度差异显著，当提取温度为50～80 ℃时不存在显著差异。因此，确定最佳提取温度为40 ℃。

2.2 乙醇浓度对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响

从图2可以看出，在料液比为1∶40、提取时间为30 min、提取温度为40 ℃的条件下，当乙醇浓度为60%～90%时总黄酮提取量差异不显著，但均显著优于乙醇浓度为50%时。当乙醇浓度为80%时，龙牙百合鳞茎的总黄酮提取量的标准误差最小，因此确定最佳乙醇浓度为80%。

2.3 料液比对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响

从图3可以看出，在提取温度为40 ℃、乙醇浓度为80%、提取时间为30 min的条件下，不同料液比对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量无明显影响。

当料液比为1∶20时，龙牙百合磷茎总黄酮提取量的标准误差最小，因此确定最佳料液比为1∶20。

2.4 提取时间对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的影响

从图4可以看出，在提取温度为40 ℃、乙醇浓度为80%、料液比为1∶20的条件下，当提取时间为20和30 min时总黄酮提取量较高，说明不同提取时间对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量有显著影响（P<0.05）。综合考虑节约时间成本和提取时间为20 min时总黄酮提取量标准误差较小的因素，确定龙牙百合鳞茎总黄酮的最佳提取时间为20 min。

2.5 正交试验结果

由表2可知，提取温度和乙醇浓度对龙牙百合鳞茎总黄酮提取量有显著影响（P<0.05），而其他因素对总黄酮提取量的影响不显著。R值越大，说明该因素的水平变动对试验结果的影响越大，4个因素对龙牙百合总黄酮提取量的影响从大到小依次为乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间，最优水平为A1B2C1D2，即提取温度为30 ℃，乙醇浓度为80%，料液比为1∶10，提取时间为20 min，在此条件下龙牙百合鳞茎总黄酮的提取效果最好。

2.6 重复性试验

在最优提取条件下，同时进行5个平行样品验证试验，结果表明总黄酮提取量为（32.236±0.513）mg/g，相对标准偏差（RSD）为2.25%，总黄酮提取量较高，重现性较好，表明此提取工艺稳定合理。

2.7 不同浓度的龙牙百合鳞茎总黄酮提取液与维生素C的体外抗氧化能力比较

从图5可以看出，不同浓度龙牙百合鳞茎的总黄酮提取液和维生素C溶液对DPPH·的清除率均随着浓度的升高而升高。龙牙百合鳞茎总黄酮提取液对DPPH·的清除率始终优于相同浓度的维生素C溶液，龙牙百合鳞茎总黄酮提取液与维生素C在相同浓度下对DPPH·的清除效果存在显著差异（P<0.05）。

3 结论与讨论

该研究结果表明：影响龙牙百合鳞茎总黄酮提取量的因素主次顺序依次为乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间；最佳提取条件为提取温度30 ℃，乙醇浓度80%，料液比1∶10，提取时间20 min。在优化的工艺条件下，总黄酮的最大提取量达到（32.301±0.513） mg/g。靳磊等[8]研究表明野生百合渥丹、山丹的总黄酮含量分别为3 134.46和2 390.80 mg/kg，而兰州百合的总黄酮含量为1 505.31 mg/kg。这说明龙牙百合鳞茎的总黄酮含量优于兰州百合。

该研究中体外抗氧化试验结果表明，在相同浓度下龙牙百合鳞茎的总黄酮提取液对DPPH·的清除能力显著优于维生素C溶液，说明龙牙百合鳞茎总黄酮表现出较好的清除DPPH·的能力。

龙牙百合作为一种传统的保健食品，目前对其鳞茎的开发和利用模式比较单一，对其鳞茎的次生代谢相关产物的提取工艺和利用研究还较少。广玉兰在乙醇

浓度70%、料液比1∶40（g∶mL）、提取时间90 min、提取温度70 ℃的条件下，总黄酮的提取率为4.896%[7]；红橘果皮在乙醇浓度70%（g ∶mL）、料液比1∶20（g ∶mL）、提取温度65 ℃和提取时间60 min的条件下，总黄酮的提取率为6.58%[4]；在工艺条件为微波时间 120 s、微波功率 400 W、液固比 33∶1的条件下，山楂叶总黄酮提取量为7.49 mg/g[5]；在浸提液为30%乙醇、料液比 1∶40、超声波（80 Hz、200 W） 处理70 min、80 ℃水浴温度下提取 2次，紫苏叶粗提液总黄酮提取率为21.81 mg/g[6]，说明植物繁殖器官的总黄酮含量整体高于营养器官。该研究结果表明龙牙百合鳞茎的总黄酮含量较其他植物的营养器官高，且有较理想的抗自由基氧化效果，这为今后研究龙牙百合对人体抗自由基的保健功能提供了新的理论依据，具有一定的实用价值。

参考文献

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