玉米花药培养影响因素的研究

董春林 张名义 杨睿

摘要[目的]研究玉米花药培养的影响因素。[方法]以5种基因型玉米为例，研究了基因型、培养基种类以及激素配比对花药诱导过程中形态变化及出愈率的影响。[结果]与YP、MS和玉培相比，N6培养基在花药培养中褐化率、膨大率和死亡率较低；先玉335花药诱导出愈率最高，为23.15%；2 mg/L 2，4-D+1.5 mg/L KT激素配比的效果最佳。[结论]该试验为玉米花药单倍体育种奠定了理论基础。

关键词 玉米；花药培养；形态变化

中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0016-03

Abstract[Objective]To research the influencing factors of maize anther cultivation. [Method] With five maize genotypes as the research materials， we researched the effects of genotype， culture medium type and hormone combination on the morphological changes and recovery rate of maize in the process of anther induction. [Result] Compared with YP， MS and Yupei， culture medium N6 had relatively low browning rate， swelling rate and mortality during the process of anther induction. Xianyu 335 had the highest induction rate， which was 23.15%. And the hormone ratio 2 mg/L 2， 4D +1.5 mg/L KT had the best effects. [Conclusion] This research laid theoretical basis for the haploid breeding of maize anther.

Key words Maize；Anther cultivation；Morphological changes

自1975年谷明光等利用花药组培技术培养出第1个玉米花粉植株以来[1]，人们不断改进组培条件，在这二三十年中，育成了“桂三1号”、“桂花1号”及“玉单358”等一系列玉米品种[2-4]。然而，玉米花药组织培养存在很大的基因障碍，且愈伤组织的分化率和再生率很低，这些因素都影响了花药组培技术在玉米育种中的应用。该试验选用了生产上大面积推广的玉米杂交种，在4种培养基条件下进行培养，通过观察玉米花药形态变化，统计其出愈率，找出培养基和材料的最适组合，从而分化再生出植株，为玉米花药单倍体育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用山西省生产上大面积推广的5个杂交种郑单958、先玉335、大丰30、晋单87和丰乐742作为供試材料。

1.2 方法

1.2.1 材料处理。

将材料分期播种于大田中，当雄穗伸出叶鞘时，镜检花药小孢子，选取发育至单核中后期，且无病虫害的雄穗，用湿纱布包好，于5 ℃冰箱中保存。

选择表面呈浅绿色的花序，剪成合适的花序段，于0.1% HgCl2中进行表面消毒4 min，之后用无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min。然后放在铺有无菌滤纸的大培养皿中。

花药接种后，在暗培养箱里进行暗培养，于31 ℃培养30 d左右。接种7 d后，每2 d观察、记录一次花药的形态变化。30 d后，将愈伤组织转入继代培养基中培养。

1.2.2 试验处理。

培养基处理：诱导培养基采用N6、YP、MS和玉培。

激素处理：添加的激素种类为生长素2，4-D、分裂素KT和6-BA，其添加量见表1。

2 结果与分析

2.1 诱导期内不同培养基对花药形态的影响

采用的诱导培养基不同，玉米花药形态变化也不同[5]。将郑单958分别接种于N6、YP、MS和玉培4种培养基上进行诱导，于2016年8月观察花药的形态变化。由图1可知，诱导期内不同培养基的玉米花藥形态具有较大差异。与其他3种培养基相比，N6培养基上的花药褐化率、膨大率和死亡率均较低，培养第8天，其褐化率为33.24%，膨大率为65.22%，死亡率为22.39%。而同一天YP培养基上的褐化率、膨大率和死亡率分别为90.88%、85.20%和54.49%，但N6培养基上出现的水渍愈伤更多，说明培养基种类对花药诱导期形态变化有较大影响。

2.2 诱导期内不同基因型对花药形态的影响

由图2可知，在同一种培养基上，不同基因型的花药在诱导期的形态变化有较大差异。先玉335和丰乐742在接种第4天花药开始膨大且出现褐化现象，而郑单958、大丰30、晋单87出现在接种后的第6～25天，晋单87的褐化率达97.40%，基本全部褐化，膨大率也高达94.00%。接种后第6天开始，花药开始呈水渍状，并开始死亡，水渍率在大约14 d内逐渐加大，随后逐渐减小。在观察的第25天，先玉335的水渍率和死亡率均最低。

2.3 不同基因型对玉米花药出愈率的影响

不同的玉米基因型会影响愈伤诱导的效率[6]，选择单核中后期的玉米花药，将其接种于N6培养基中诱导，不同基因型玉米的出愈率相差较大，与诱导期花药形态变化基本一致，先玉335出愈率最高，为23.15%，丰乐742最低，为1.43%，而晋单87最终全部褐化死亡，未形成愈伤组织。结果说明玉米基因型是玉米花药组织培养最重要的因素之一，需要选择合适的基因型才能育出单倍体玉米品种。

2.4 不同培养基对玉米花药出愈率的影响 培养基成分不同，则玉米花药的出愈率也会不同[7]，用郑单958、先玉335、大丰30、晋单87和丰乐742进行激素配比筛选试验。在基本培养基N6上加入2 mg/L 2，4-D及不同浓度的KT和6-BA。结果显示，同样浓度的2，4-D条件下，加入分裂素能促进愈伤组织的形成，且KT的作用优于6-BA。该试验中，2 mg/L 2，4-D+1.5 mg/L KT促进愈伤组织形成的效果最佳，出愈率最高，與郭新梅等的研究一致[8]。而晋单87在N6培养基上全部褐化死亡，即使加入激素仍不能缓解其褐化死亡，说明N6培养基不适合该基因型。

3 结论

培养基是外植体的主要营养来源，不同的培养基出愈率具有较大的差异。该试验利用4种不同的培养基，观察诱导期间花药的形态变化，并统计其水渍愈伤率、褐化率、膨大率和死亡率，得出N6培养基更适用于花药培养的结论。同时，生长素2，4-D和分裂素KT能有效促进愈伤组织的形成，而6-BA效果较不明显。此外，基因型是影响玉米花药培养的重要因素之一，该试验利用5种不同基因型材料进行花药离体培养，其出愈率有明显差异，其中先玉335出愈率最高，为23.15%，而晋单87未形成愈伤组织，说明选择正确的基因型对愈伤组织的诱导及获得单倍体玉米材料至关重要。

参考文献

[1] 中国科学院遗传研究所组织培养实验室四室一组.诱导玉米花粉植株的初步研究[J].遗传学报，1975（2）：138-142.

[2] 北京海淀区东北旺公社试验站，中国科学院北京植物研究所玉米單倍体育种协作组.玉米花药培养的研究初报[J].植物学报，1975，18（2）：180-182.

[3] 广西壮族自治区玉米研究所，北京市海淀区东北旺公社试验站，中国科学院北京植物研究所.玉米花药培养的研究[J].植物学报，1977，19（2）：89-94，169.

[4] 吴甲林，钟秋兰，农方红，等.花药培育成玉米纯系及其杂交组合的试种[J].中国科学，1983，13（2）：154-161.

[5] 金航，张金渝，张智慧.影响花药培养的主要因素[J].现在中药研究与实践，2006，20（3）：61-64.

[6] 原玉香，耿建峰，张晓伟，等.影响玉米花药培养效率的因素研究[J].华北农学报，2001，16（3）：12-16.

[7] 郭奕明，杨映根，郭仲琛.玉米花药培养和单倍体育种的研究新进展[J].植物学通报，2001，18（1）：23-30.

[8] 郭新梅，叶克苁，裴玉贺，等.影响玉米花药培养特性关键因素的研究[J].玉米科学，2013，21（4）：83-88.