2种野外采集白腐真菌分离及其产漆酶液体培养基优化

李环明 杨洪升 薛春梅

摘要[目的]优化2种野外采集白腐真菌菌丝产漆酶液体培养基。[方法]对2种采集的白腐真菌轮纹韧革菌（Stereum ostrea）和朱红密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）通過分离纯化得到白腐真菌菌丝，应用ABTS法测定其产漆酶活性，研究碳源、氮源、金属阳离子、pH、温度、转速对白腐真菌产漆酶的影响。[结果]轮纹韧革菌最佳培养基是葡萄糖20.00 g、硝酸钾5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、温度25 ℃、转速170 r/min，在第11天其产漆酶活性达到最大，为1.557 U/mL，是PDA液体培养基产漆酶活性的2.7倍。朱红密孔菌最佳培养基是麦芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、溫度30 ℃、转速200 r/min，在第9天其产漆酶活性达到最大，为1.478 U/mL，是PDA液体培养基产漆酶活性的2.3倍。[结论]筛选出2种野外白腐真菌产漆酶最佳培养基，为漆酶的进一步研究提供了参考。

关键词 白腐真菌；漆酶；培养基；筛选

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0001-03

Abstract[Objective] The aim was to optimize the liquid culture medium of two species of field acquisition white rot fungi.[Method] By isolating and purifying two species of white rot fungi，Stereum ostrea and Pycnoporus cinnabarinus，white rot fungus hyphae were collected，and the liquid culture medium of laccase was screened.ABTS method was applied to measure the activity of laccase.Effects of carbon sources，nitrogen sources，metal cations，pH，temperature and rotational speed on laccase produced by white rot fungi were studied.[Result] The optimum medium of Stereum ostrea was glucose 20.00 g，potassium nitrate 5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g，the initial pH 6，temperature 25 ℃， rotational speed 170 r/min，and the laccase activity reached the maximum on the 11th day the maximum value reached 1.557 U/mL which was 2.7 times of the laccase activity of PDA liquid culture.The optimum medium of Pycnoporus cinnabarinus was maltose 25.00 g，yeast extract 5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g，the initial pH 7，temperature 30 ℃，rotational speed 200 r/min，and the laccase activity reached the maximum in the 9 d，the maximum value 1.478 U/mL which was 2.3 times of the laccase activity of PDA liquid culture.[Conclusion] The opitimal liquid culture medium of two species of field acquisition white rot fungi is obtained so as to provide reference for further study of laccase.

Key words White rot fungus；Laccase；Culture medium；Screen

白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的真菌，可在特定条件下产各种酶系[1]，包括漆酶、木质素过氧化氢酶和锰过氧化氢酶等[2-3]。在白腐真菌产的酶系中，漆酶的应用非常广泛。在染料脱色方面，马利[4]、傅恺[5]、张丽[6]、王天女等[7]对重组血红密孔菌产漆酶对活性蓝等染料进行脱色结果分析，其脱色率达93%。在环境污染的处理方面，彭丹对黄孢原毛平革菌在固态发酵体系产真菌漆酶对五氯酚（PCP）降解进行研究，结果表明在没有氧化还原介体时粗漆酶液能降解PCP，反应6 h降解率为37.8%，粗酶液中加入5 mmol/L氧化还原介体（ABTS）能获得更高的降解率，达97.0%；将粗漆酶液用（NH4）2SO4盐析纯化，用提纯后漆酶降解PCP，6 h后降解率为81.8%[8-9]。在农药处理方面，程科[1]对白腐菌漆酶纯化分离并对阿特拉津进行降解研究，结果表明，在最优降解条件下，阿特拉津降解率响应预测值为52.41%，验证值为52.32%，最适条件下的降解率提高了10%～15%。此外，漆酶能选择性地催化木质素降解，这一特性可用于纸浆生产。漆酶还可用来测定食品中抗坏血酸的总含量，该方法已应用于白酒、啤酒、奶粉等食品检测[10]。笔者研究了2种野外采集的白腐真菌液体粗酶液中漆酶的活性，对产漆酶的液体培养基进行优化，以期得到最佳的培养基配方。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂。

恒温水浴锅、YXQ-LS-立式压力蒸汽灭菌锅、KA-1000低速离心机、BS-2F振荡培养箱、ZHWY-2102全温摇床振荡器、SPX-250B-G型恒温光照培养箱。呋喃西林、ABTS、KNO3、MgSO4、NaH2PO4、H2O2、CuSO4、CaCl2、KCl、ZnSO4、醋酸-醋酸钠缓冲液。

1.1.2 供试菌种。菌种采于佳木斯市四丰乡小桦山，根据真菌鉴定图谱鉴定为轮纹韧革菌、朱红秘孔菌。

1.1.3 培养基。

PDA选择培养基：土豆100.00 g，葡萄糖5.00 g，呋喃西林0.25 g，琼脂10.00 g，定容至500 mL。斜面培养基：称去皮马铃薯200.00 g，切成小块，加适量（完全浸没马铃薯）蒸馏水，煮20～30 min，用9层纱布过滤出马铃薯浸出液，加入葡萄糖20.00 g、NaH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、琼脂20.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL[11]。液体标准培养基：马铃薯200.00 g，煮20～30 min，用9层纱布过滤，加入葡萄糖20.00 g、NaH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、蛋白胨5.00 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種分离及扩大培养。先用75%乙醇擦拭1次，用剪刀剪开菌体，在中间剪一小块菌体接种到PDA选择培养基上，当菌丝萌发至长2 cm时，切取菌丝尖端1 mm左右，接入新配制PDA母种培养基上，重复3～5次，以不长杂菌为分离成功[1]。

1.2.2 液体菌种的制备。在每瓶PDA液体培养基中接种3块10 mm的菌片，25 ℃、110 r/min培养13 d。

1.2.3 培养基的筛选。

1.2.3.1 碳源筛选。以不加马铃薯的液体标准培养基为基准，设置葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖5个不同碳源处理，另设不加碳源为对照，筛选最佳碳源。

1.2.3.2 氮源筛选。设置硝酸钾、硫酸铵、 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨5个氮源处理，以不加氮源为对照，筛选最佳氮源。

1.2.3.3 金属阳离子筛选[6]。设置Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+、Cu2+5个因素，以不加金属阳离子为对照。

1.2.3.4 营养因素正交试验。试验因素与水平见表1。

1.2.3.5 温度的筛选。以营养因素正交试验筛选出来的最佳组合为基础培养基，分别设置15、20、25、30、35、40 ℃共6个不同温度处理。

1.2.3.6 初始pH的筛选。用5% NaOH和0.2 mol/mL HCl将发酵培养基的初始pH分别设置为4、5、6、7、8、9。

1.2.3.7 摇床转速筛选。设置110、140、170、200、230 r/min，以不设转速为对照。

1.2.3.8 培养时间的筛选。根据对2种白腐真菌培养基营养因素及条件的筛选，最后得出最佳培养基配方，并且进行培养，测定1、3、5、7、9、11、13、15 d等不同时间段产漆酶活性。

1.2.4 漆酶活性测定。

1.2.4.1 胞外酶的提取。对液体培养基进行纱布过滤，冰箱冷藏24 h后4 000 r/min离心15 min，上清液即为胞外提取液[12-13]。

1.2.4.2 漆酶活性测定。采用ABTS法。

空白样（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS +1.2 mL去离子水+0.4 mL失活酶液。样品（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS+1.2 mL去离子水+0.4 mL酶液。在40 ℃下应用可见分光光度计检测420 nm波长处吸收值变化，30 s间隔读数，记录240 s内吸收值变化，定义1 min内氧化1 μmol ABTS所需要的酶量为1个漆酶活力单位（U），已知420 nm波长处ABTS摩尔消光系数ε420=3.6×104 L/（mol·cm）。

2 结果与分析

2.1 营养因素对白腐真菌产漆酶的影响

5种碳源中，轮纹韧革菌产漆酶液体培养基中最佳碳源是葡萄糖，其产漆酶最大值为0.578 U/mL；朱红密孔菌产漆酶液体培养基中最佳碳源是麦芽糖，其产漆酶最大值为0.642 U/mL（图1）。

5种氮源中，轮纹韧革菌产漆酶液体培养基中最佳氮源是硝酸钾，其产漆酶最大值为1.069 U/mL；朱红密孔菌产漆酶液体培养基中最佳氮源是酵母膏，其产漆酶最大值为0.752 U/mL（图2）。

2.2 金属阳离子对白腐真菌产漆酶的影响

由图3可知，金属阳离子Mg2+、Cu2+對轮纹韧革菌产漆酶都有促进作用，Cu2+对轮纹韧革菌促进最大，在添加了Cu2+的液体培养基中，其产漆酶最大值为1.349 U/mL。而Ca2+对其有抑制作用，添加了Ca2+的液体培养基产漆酶值为0.389 U/mL，Zn2+、K+影响不大，和不加金属离子产漆酶相差不大。

金属阳离子K+、Mg2+、Cu2+对朱红密孔菌产漆酶都有促进作用，K+对朱红密孔菌促进作用最大，在添加了K+的液体培养基中，其产漆酶最大值为0.931 U/mL。而Ca2+对其有抑制作用，添加了Ca2+的液体培养基产漆酶值为0.056 U/mL，Zn2+对朱红密孔菌产漆酶影响不大。

2.3 不同营养因素正交试验结果

综合评价，轮纹韧革菌液体营养因素培养基最优组合为A2B2C3D1，此时获得的菌丝产漆酶为1.386 U/mL。即优化后的最适培养基为：葡萄糖20.00 g，硝酸钾5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g。由极差R值可知，影响菌丝体产漆酶的因素大小顺序为葡萄糖、硝酸钾、CuSO4和NaH2PO4，葡萄糖和硝酸钾对试验结果有极显著影响（表2）。

朱红密孔菌液体营养因素培养基最优组合为A3B2C1D3，此时获得的菌丝产漆酶为0.940 U/mL。即优化后的最适培养基为：麦芽糖25.00 g，酵母膏5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g。由极差R值可知，影响菌丝体产漆酶的因素大小顺序为麦芽糖、酵母膏、NaH2PO4和KCl，麦芽糖和酵母膏对试验结果有极显著影响（表3）。

2.4 培养条件对白腐真菌产漆酶的影响

2.4.1 pH对白腐真菌产漆酶的影响。

由图4可知，轮纹韧革菌在pH 6的液体培养基中产漆酶量最大，为1.395 U/mL，且偏碱的培养基不适合菌丝体产漆酶。朱红密孔菌产漆酶最适pH为7，产漆酶最大值为0.940 U/mL，偏碱的培养基对其有抑制作用。

2.4.2 温度对白腐真菌产漆酶的影响。

由图5可知，轮纹韧革菌最适温度为25 ℃，产漆酶最大值为1.386 U/mL，朱红密孔菌最适温度为30 ℃，产漆酶最大值为0.972 U/mL。温度过高和过低，2种白腐真菌漆酶活性都降低。

2.4.3 转速对白腐真菌产漆酶的影响。

由图6可知，轮纹韧革菌最佳转速为170 r/min，产漆酶最大值为1.482 U/mL，朱红密孔菌最佳转速为200 r/min，产漆酶最大值为1.117 U/mL，在静置状态下2种白腐真菌产漆酶活性都非常低。

2.5 培养时间对产漆酶的影响 结果表明，轮纹韧革菌在最佳培养基培养下，开始1～5 d漆酶活性较低，在第7天有下降，7～11 d快速增长并且达到最大，在第11天其产漆酶活性为1.557 U/mL，13～15 d漆酶活性稍有下降，并且达到平稳。朱红密孔菌在最佳培养基培养下，开始1～3 d漆酶活性较低，3～7 d平稳增长，并且在7～9 d快速增长，达到最大，在第9天其产漆酶活性为1.478 U/mL，在11 d有下降，11～13 d产漆酶活性变化不大，到15 d又有下降。

3 结论

轮纹韧革菌最佳培养基是葡萄糖20.00 g、硝酸钾5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、温度25 ℃、转速170

r/min，在第11天其产漆酶活性达到最大，为1.557 U/mL，是PDA液体培养基产漆酶活性的2.7倍。朱红密孔菌最佳培养基是麦芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、温度30 ℃、转速200 r/min，在第9天其产漆酶活性达到最大，为1.478 U/mL，是PDA液体培养基产漆酶活性的2.3倍。通过对2种白腐真菌产漆酶培养基的筛选，得出最佳培养基配方，为后期的漆酶研究提供了理论依据。

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