香菇液体培养基优化及其体外抗氧化活性研究

马银鹏，于丽萍，2，马鸣，韩冰，孔祥辉，2，*

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨150020；3.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150028）

香菇液体培养基优化及其体外抗氧化活性研究

马银鹏1，于丽萍1，2，马鸣3，韩冰3，孔祥辉1，2，*

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨150020；3.哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨150028）

以香菇液体发酵胞外粗多糖得率为主要评价指标，通过正交试验研究液体发酵最优培养基配方；测定胞外和胞内粗多糖中蛋白质、还原糖和多糖含量，并研究其体外对羟自由基和DPPH自由基的清除率。结果表明：香菇液体发酵最优配方为葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麦麸皮24 g。此配方下香菇胞外粗多糖中蛋白质含量0.68%，还原糖含量6.17%，多糖含量25.6%；胞内粗多糖中蛋白质含量1.16%，还原糖含量7.01%，多糖含量32.3%；胞外粗多糖对羟自由基清除率为63.05%，对DPPH自由基清除率为62.05%。

香菇；液体培养；多糖；抗氧化活性

香菇，又名花菇、香蕈、冬菇，是世界第二大食用菌，称为“山珍之王”[1]。香菇含有香菇多糖，具有分支的β-（1-3）-D-葡聚糖[2-3]，是一种宿主免疫增强剂[4-5]，具有抗肿瘤[6]、调节免疫功能[7]、抗病毒[8]、刺激干扰素生成、保肝解毒等多种活性[2-3，9]，目前已作为免疫增强剂用于临床治疗。香菇多糖具有很强抗衰老和抗氧化等活性[2，10-12]，研究香菇多糖抗氧化活性有助于降低细胞衰老速度，达到延年益寿的目的。因此，研究其抗氧化性对香菇多糖进一步产业化开发具有极大潜在价值[13]。

目前，人们对香菇多糖的研究和开发利用主要集中在子实体多糖的研究上，而利用香菇菌丝体的研究报道较少[14]。液体深层发酵技术可生产食用菌菌丝体，同时获得具有功效成分的发酵液[15]。用工业化液体发酵技术生产食用菌蛋白质，比饲养家禽或家畜来获取蛋白质的时间短、效率高、成本低[16]。因此，食用菌深层发酵在食品工业方面有很大发展，有望成为21世纪人类所需主要蛋白质的来源之一。液体发酵食用菌菌丝体还可用于制药，对于在人工栽培条件下不易形成子实体或者其菌丝体与子实体含相类似有效成分的蕈菌，可利用发酵产物代替子实体[15]。目前，我国市场上供应的食用真菌药物，如蜜环片、灵芝菌片、宁心宝胶囊等均已采用液体发酵菌丝体生产[17]。食用菌的培植开始从农业生产跨入了工业化生产时代[18]。

本研究以香菇为研究对象，通过正交试验获得最优培养基配方，并提取香菇发酵体系的胞内粗多糖和胞外粗多糖，测定粗多糖中蛋白质、还原糖和多糖含量，并研究其对羟自由基和DPPH自由基清除率，为香菇多糖抗氧化产品的研发奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

香菇菌株2205：黑龙江省科学院微生物研究所；马铃薯、麦麸皮：市售。

1.1.2 试验试剂和主要仪器

硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、苯酚、硫酸（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250：上海星科生物技术有限公司；重蒸酚：北京索莱宝科技有限公司；牛血清蛋白：北京奥博星生物技术有限公司；3，5-二硝基水杨酸：合肥博美生物科技有限公司；硫酸亚铁、水杨酸：天津市光复精细化工研究所；酵母膏：上海缘泰生物有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基（DPPH）：纳川生物技术工作室。

台式高速高性能冷冻离心机TGL20M-II：湖南凯达科学仪器有限公司；卧式精密摇床ZHWY-211B：河北德科机械科技公司；紫外可见分光光度计UV757CRT：上海仪电分析仪器有限公司；旋转蒸发仪RE-53AA：北京瑞成伟业仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香菇菌种活化

取200 g去皮马铃薯切片，煮沸30 min，滤液加酵母膏2 g、葡萄糖20 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g，定容至1 000 mL，121℃湿热灭菌30 min。接种后于25℃，180 r/min培养10 d。

1.2.2 香菇最优培养基配方研究

采用两种碳源（葡萄糖和可溶性淀粉）、两种氮源（酵母膏和麦麸皮），选择L9（34）正交表设计正交试验，每组3个重复。其中KH2PO4和MgSO4分别为0.1 g，维生素B12 mg。正交试验因素和水平见表1。

表1 正交试验因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.3 香菇粗多糖提取

1.2.3.1 菌丝体处理

用八层纱布过滤香菇发酵菌液，沉淀用蒸馏水洗涤至无色后备用，滤液于4℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 胞外粗多糖的制备

采用旋转蒸发仪，75 r/min，将过滤后的发酵液旋转蒸发至约10 mL，用3倍体积的95%乙醇沉淀，4℃醇沉12 h，5 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀用80%的乙醇润洗3次，于60℃烘干，获得胞外多糖粗样品。

1.2.3.3 胞内粗多糖的制备

取过滤后的沉淀物，加30倍蒸馏水，用匀浆器打匀，95℃浸提1 h，4 000 r/min离心20 min，取上清液1。对沉淀物重复上述操作，获得上清液2。上清液1和上清液2混合，旋转蒸发至约10 mL，用3倍体积95%乙醇，4℃醇沉12 h后，5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀用80%乙醇润洗3次，于60℃烘干，获得胞内多糖粗样品。

1.2.4 考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量

称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，并用蒸馏水定容至1000 mL，备用。称取牛血清蛋白，用蒸馏水配成100μg/mL的标准溶液。依次吸取牛血清蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL入试管中，以水补足至1.0 mL，加入考马斯亮蓝G-2505mL，于595nm处测定吸光度，以蒸馏水作对照，绘制标准曲线。称取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸馏水溶解，5 000 r/min离心5 min取上清液，吸取上清液1 mL，加入考马斯亮蓝G-250 5 mL，测定同标准溶液，计算可溶性蛋白含量。

1.2.5 3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量

准确称取烘干至恒重葡萄糖200 mg，配制2 mg/mL葡萄糖标准溶液。依次吸取葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到5支试管中，以水补足至1.0 mL，分别加入DNS 2 mL，沸水浴中加热2 min，取出置冰水中迅速冷却，分别加入蒸馏水9 mL，摇匀，于540 nm处测定吸光度，以蒸馏水作对照，绘制标准曲线。称取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸馏水溶解，5 000 r/min离心5 min，吸取上清液1 mL，加DNS 2 mL，处理同标准溶液，计算多糖含量。

1.2.6 苯酚硫酸法测多糖含量

称取100 mg烘干至恒重葡萄糖，加水溶解定容至100 mL，得葡萄糖标准溶液。分别取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL加入8支试管中，以水补足至2.0 mL，加入体积分数为5%的重蒸酚溶液1 mL，5 mL浓硫酸，迅速振荡均匀。100℃水浴15 min，迅速于冰水中冷却，于490 nm处测定吸光度，以蒸馏水作对照，绘制标准曲线。称取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸馏水溶解，5 000 r/min离心5 min取上清液，吸取上清液1 mL，加蒸馏水补足至2 mL，处理同标准溶液，计算多糖含量。

1.2.7 羟自由基清除率的测定

胞外粗多糖样液浓度为2 mg/mL。在A0试管中分别加入硫酸亚铁1 mL、水杨酸1 mL、蒸馏水2 mL、H2O21 mL，不加样品溶液。在AX中分别加入硫酸亚铁1 mL、水杨酸1 mL、蒸馏水2 mL、H2O21 mL、样品溶液2 mL。在AX0中分别加入硫酸亚铁1 mL、水杨酸1 mL、蒸馏水2 mL、样品溶液2 mL，不加H2O2。最后将每支试管加蒸馏水补足至7mL，再于510nm处测定吸光值。再将粗多糖样液稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，并分别配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC溶液，在相同操作下测定吸光值，对比多糖溶液和VC溶液和清除率的关系。

式中：A0为空白样的吸光值，即不加样品溶液；Ax为样品组的吸光值，即加显色剂H2O2和样品溶液；Ax0为样品本底吸光值，即不加显色剂H2O2。

1.2.8 DPPH自由基清除率的测定

胞外粗多糖样液浓度为2 mg/mL。取2 mL试样于试管中，加入DPPH溶液2 mL，充分摇匀后，室温下避光静置30 min，于517 nm处测定吸光度。再将粗多糖样液稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，并分别配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC溶液，在相同操作下测定吸光值，对比多糖溶液和VC溶液和清除率的关系。

式中：A样为DPPH和多糖均加入的体系；A对照为不加多糖溶液的体系；A空白为不加DPPH的体系。

2 结果与讨论

2.1 香菇最优培养基配方

葡萄糖和可溶性淀粉作为香菇菌丝体的碳源，酵母膏和麦麸皮作为香菇菌丝体的氮源，为香菇菌丝体生长提供必需营养成分。每种碳源和氮源添加量不同，胞外和胞内多糖产量存在差异。正交试验表见表2。

表2 L9（34）正交试验表Table 2 The L9（34）table of orthogonal test

以为葡萄糖（A）、酵母膏（B）、可溶性淀粉（C）、麦麸皮（D）为考察因素，以胞外多糖为评价指标，正交试验设计与结果见表2。由极差分析可知，液体发酵培养基对胞外粗多糖产量的影响主次为A＞D＞C＞B。由方差分析可知最优方案为A3B3C2D3，即葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麦麸皮24 g。以此配方进行验证试验，此最优配方下胞外多糖含量为5.917 4 g。

以胞内多糖为评价指标，正交试验设计与结果见表2。由极差分析可知，液体发酵培养基对胞内粗多糖产量的影响主次为A＞C＞D＞B。由方差分析可知最优方案为A3B1C1D3，即葡萄糖9 g、酵母膏0.3 g、可溶性淀粉3 g、麦麸皮24 g。以此配方进行验证试验，此最优配方下胞内多糖含量为0.821 3 g。

综合胞外多糖和胞内多糖正交试验结果和验证试验结果，选择以胞外多糖得率为评价指标，香菇液体发酵最优培养基配方为葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麦麸皮24 g。

2.2 可溶性蛋白含量测定

蛋白质浓度标准曲线如图1所示，回归方程为Y= 0.059X+0.0001，R2=0.993。

图1 蛋白质浓度标准曲线Fig.1 The standard curve of protein concentration

测得香菇胞内粗多糖中蛋白质含量为1.16%，胞外粗多糖中蛋白质含量为0.68%。

2.3 还原糖含量测定

葡萄糖浓度标准曲线如图2所示，回归方程为Y= 0.743X-0.020，R2=0.997。

图2 葡萄糖浓度标准曲线Fig.2 The standard curve of glucose concentration

测得香菇胞内粗多糖中还原糖含量为7.01%，胞外粗多糖中还原糖含量为6.17%。

2.4 多糖含量测定

葡萄糖浓度标准曲线如图3所示，回归方程为Y= 0.012X-0.010，R2=0.997。测得香菇胞内粗多糖中多糖含量为32.3%，胞外粗多糖中多糖含量为25.6%。

2.5 羟自由基清除率测定

香菇胞外粗多糖对羟自由基清除率为（60.67± 1.09）%。不同多糖和VC浓度下羟自由基清除率结果如图4所示。

羟自由基清除率均随多糖浓度和VC浓度的增加而提高。当浓度小于1.0 mg/mL时，香菇胞外多糖较VC对羟自由基清除率大，当浓度为1.0 mg/mL时，两者对羟自由基清除率基本相当。

图3 葡萄糖浓度标准曲线Fig.3 The standard curve of glucose concentration

图4 不同多糖与VC浓度对羟自由基的清除率Fig.4 The clearance rate of hydroxyl radical with different polysaccharide and VCconcentration

2.6 DPPH自由基清除率测定

香菇胞外粗多糖对DPPH自由基清除率为（60.57± 2.02）%。不同多糖浓度和不同VC浓度下DPPH自由基清除率结果如图5所示。

图5 不同多糖与VC浓度对DPPH自由基的清除率Fig.5 The clearance rate of DPPH with different polysaccharide and VCconcentration

随着多糖浓度的增加，对DPPH自由基的清除率逐渐增加，但是VC浓度对DPPH自由基的清除率基本保持在一个较高水平。随着浓度增加，多糖和VC对DPPH自由基的清除率逐渐接近。

3 结论

以胞外粗多糖产量为指标，正交试验获得香菇液体发酵培养基最优配方：葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麦麸皮24 g。此配方下香菇胞外粗多糖中可溶性蛋白含量为0.68%，还原糖含量为6.17%，多糖含量为25.6%；胞内粗多糖中可溶性蛋白含量为1.16%，还原糖含量为7.01%，多糖含量为32.3%。

香菇液体发酵胞外粗多糖对羟自由基清除率为60.67%，较VC对羟自由基清除率好；对DPPH自由基清除率为60.57%，随着浓度增加，多糖和VC对DPPH自由基的清除率逐渐接近。

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The Optimal Formula of Liquid Medium on Lentinus edodes and Its Antioxidant Activities in vitro

MA Yin-peng1，YU Li-ping1，2，MA Ming3，HAN Bing3，KONG Xiang-hui1，2，*
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，Heilongjiang，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，Heilongjiang，China；3.Harbin University of Commerce，Harbin 150028，Heilongjiang，China）

The extracellular polysaccharide yields of Lentinus edodes liquid fermentation was took as main evaluation index to determine the optimal formula of liquid fermentation medium.The protein，reducing sugar and polysaccharide content of extracellular and intracellular polysaccharide was also studied.Then its clearance rate to hydroxyl radical（·OH）and DPPH·was studied in-vitro.The results showed that the optimal formula of L.edodes liquid fermentation contains glucose 9 g，yeast extract 0.9 g，soluble starch 6 g，wheat bran 24 g.We found that the protein content in extracellular polysaccharide of L.edodes accounts for 0.68%，reducing sugar content was 6.17%，polysaccharides content was 25.6%；protein content in intracellular polysaccharide was 1.16%，reducing sugar content was 7.01%，polysaccharides content was 32.3%.The clearance rate of extracellular polysaccharide to hydroxyl radical was 63.05%，to DPPH free radicals was 62.05%.

Lentinus edodes；liquid medium；polysaccharides；antioxidant activities

2016-12-09

黑龙江省科研机构创新能力提升专项计划（YC2015D002）

马银鹏（1987—），男（汉），助理研究员，硕士，研究方向：食用菌功效成分分离纯化及活性研究。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.003