肾细胞癌中DACT2基因启动子区甲基化状态与mRNA表达的研究

樊 博，齐 盼，张爱莉，赵志红，倪晓辰，刘 彬，马永良，任宗涛

(河北医科大学第四医院泌尿外科，石家庄 050000)



肾细胞癌中DACT2基因启动子区甲基化状态与mRNA表达的研究

樊 博，齐 盼，张爱莉△，赵志红，倪晓辰，刘 彬，马永良，任宗涛

(河北医科大学第四医院泌尿外科，石家庄 050000)

目的 探讨DACT2基因在肾细胞癌(RCC)发生、发展中的作用。方法 收集该院2014年8月至2015年8月59例住院RCC患者肾癌根治术后RCC及相应癌旁组织、正常组织标本，分别应用甲基化特异性PCR(MSP)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测其DACT2基因甲基化状态、mRNA表达情况，应用免疫组织化学过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)法检测其细胞质内β-catenin蛋白的表达，并分析RCC组织DACT2基因甲基化状态及mRNA表达与临床病理特征的关系，以及DACT2基因甲基化与mRNA及β-catenin表达的关系。结果 RCC组织中DACT2 mRNA相对表达水平(0.427±0.025)明显低于癌旁组织(0.801±0.047)和正常组织(0.872±0.022)，RCC组织中DACT2基因甲基化阳性率(45.76%)明显高于癌旁组织(6.78%)及正常组织(5.08%)，差异均有统计学意义(P<0.05)，而癌旁组织与正常组织比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在RCC组织中DACT2基因mRNA相对表达水平及启动子区甲基化发生率与患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、Fuhrman分级等临床资料间均无明显相关性(P>0.05)。甲基化组中DACT2基因的mRNA相对表达水平低于非甲基化组，差异有统计学意义(P<0.05)。RCC组织中β-catenin蛋白在细胞质中的表达率高于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，且DACT2基因甲基化与β-catenin蛋白表达呈正相关(r=0.324，P=0.012)。结论 DACT2基因启动子区甲基化及其mRNA相对表达水平降低可能参与RCC的发生，但与RCC的临床进展无关，DACT2基因启动子区发生甲基化可能是引起其mRNA相对表达降低的原因之一，且肾癌组织DACT2基因甲基化的发生可能与β-catenin的高表达有关。

肾肿瘤；DACT2；启动子；甲基化；RNA，信使

表1 RT-PCR及MSP引物序列及反应条件

DACT家族基因是近年来研究较多的一种新的信号通路调控因子，其主要通过对Wnt/β-catenin信号传导通路进行负调控来抑制肿瘤的形成。近年来也有研究表明，由于DACT2基因启动子区发生甲基化导致其表达失活，在肝癌、胃癌、食管癌、乳头状甲状腺癌及结肠癌等恶性肿瘤的发生中起着重要的作用。然而，DACT2基因在肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)中的功能及其相应的表观遗传学作用尚未见报道。本研究提取59例RCC患者术后所得正常肾组织、癌旁组织及癌组织的RNA与DNA，应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测DACT2基因mRNA的相对表达水平，并应用甲基化特异性PCR(MSP)技术对DACT2基因启动子甲基化状态进行检验。此外，本研究还通过分析各组织中DACT2基因mRNA相对表达水平及其启动子区甲基化状态与临床资料之间的关系，并结合免疫组织化学方法检测其在肾癌组织、癌旁及正常组织中的表达情况，并进行相应统计学分析，以进一步揭示RCC的发病机制，为RCC的早期发现、诊治与预后的判断提供相应的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年8月至2015年8月本院泌尿外科59例住院患者肾癌根治术后标本，术后病理结果均确诊为RCC。其中男36例，女23例；年龄24～82岁，中位年龄为61岁；术前均未接受放、化疗；根据1997年世界卫生组织(WHO)推荐Fuhrman分级：高分化34例，中分化18例，低分化7例；按照2002年美国肿瘤研究联合会(AJCC)分期标准分为：Ⅰ期42例，Ⅱ期14例，Ⅲ+Ⅳ期3例。每例患者术后均取癌组织、癌旁组织(距癌组织2 cm处)与正常组织标本3份。

1.2 主要仪器与试剂 蛋白酶K(上海生工生物公司)、TRNzol(天根生化科技有限公司)、互补DNA(cDNA)第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)、DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(天根生化科技有限公司)、MSP试剂盒(天根生化科技有限公司)、蓝色体系(康为世纪有限公司)、RT-PCR引物(北京六合华大基因)、MSP引物(上海生工生物公司)、β-catenin鼠单克隆抗体(北京中衫金桥生物技术有限公司)，鼠二抗免疫组化试剂盒[通用型Biotin链霉卵白素-辣根过氧化物酶复合物(SP-HRP)免疫组织化学试剂盒，北京中衫金桥生物技术有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR检测DACT2 mRNA的表达 标本提取后及时按TRIzol试剂说明书提取总RNA，并参照反转录试剂盒(cDNA第一链合成试剂盒)说明书的比例加样，将RNA反转录成cDNA保存于-80 ℃冰箱备用。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照，引物及退火温度见表1。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，采用Gelwork22 ID软件，对电泳图像中DACT2的表达进行半定量。以DACT2条带的吸光度(A)值与GAPDH条带的A值的比值作为DACT2基因的相对表达量。

1.3.2 MSP检测DACT2基因的甲基化状态 酚/氯仿抽提法提取癌组织、癌旁组织及正常组织组基因DNA。参照DNA重亚硫酸盐转化试剂盒说明书的比例加样，经亚硫酸氢盐处理后，DNA中的C转变为U，而基因的CpG岛发生甲基化后，则不能发生这种改变，根据此原理设计相应的甲基化和非甲基化引物，检测该基因是否发生甲基化。具体引物序列及退火温度见表1。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析。MSP阳性对照采用健康人外周血淋巴细胞DNA，经CpG甲基转移酶处理后进行PCR，阴性对照用灭菌双蒸水取代DNA模板进行PCR。

1.3.3 免疫组织化学法检测β-catenin的表达 β-catenin采用常规SP法。4 μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇室温孵育20 min；pH 8.0乙二胺四乙酸(EDTA)高压锅抗原修复2 min，蒸馏水洗涤，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min，2次，其后的试验步骤按SP试剂盒说明书进行，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。设PBS代替一抗为空白对照，己知阳性片作阳性对照，作为质量控制标准。

2 结 果

2.1 RCC中DACT2 mRNA表达 检测59例RCC组织及相应的癌旁及正常组织中DACT2 mRNA表达情况，见图1。DACT2 mRNA在RCC和癌旁及正常组织中的相对表达水平分别为0.427±0.025、0.801±0.047、0.872±0.022。RCC组织中DACT2 mRNA相对表达水平明显低于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。在RCC患者中，DACT2 mRNA表达与患者的临床分期及肿瘤的组织分化程度、年龄、性别、肿瘤大小等均无相关性(P>0.05)，见表2。

A：正常组织；B：RCC组织

图1 正常及RCC组织中β-catenin蛋白免疫组织化学结果(IHC×200)

2.2 RCC中DACT2基因甲基化状态 DACT2基因在检测的59例患者RCC组织及相应的癌旁及正常组织中甲基化发生率分别为45.76%(27/59)，6.78%(4/59)，5.08%(3/59)。RCC组织中DACT2基因甲基化阳性率明显高于癌旁组织及正常组织(P<0.05)。癌旁组织及正常组织中DACT2基因甲基化发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在RCC组织中DACT2基因启动子区甲基化的发生率与患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、Fuhrman分级(组织学分级)等临床资料间均无明显相关性(P>0.05)，见表3。

表2 RCC组织中DACT2 mRNA表达与患者临床病理特征的关系(n)

表3 RCC组织中DACT2 甲基化状态与患者临床病理特征的关系(n)

2.3 RCC组织中DACT2基因甲基化发生率与mRNA相对表达水平的关系 59例患者RCC组织中甲基化者DACT2基因的mRNA相对表达水平(0.405±0.014)明显低于非甲基化者(0.445±0.015)，差异有统计学意义(t=-10.868，P=0.000)。

2.4 RCC中β-catenin的表达 β-catenin在正常肾小管上皮细胞细胞质低表达或不表达；在肾癌中细胞质高表达或蓄积(图1)。在RCC组织中的阳性表达率为77.97%(46/59)，明显高于癌旁15.25%(9/59)及正常组织11.86%(7/59)，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析DACT2基因甲基化状态与β-catenin表达间的关系，在DACT2基因甲基化阳性的RCC组织中，其β-catenin表达率为 92.59%(25/27)，经Spearman等级相关分析，二者呈明显正相关(r=0.324，P=0.012)，见表4。

表4 肾癌组织中DACT2基因甲基化与β-catenin蛋白表达的关系

3 讨 论

恶性肿瘤是在内部和外部多种因素共同作用下，使某些细胞在基因水平上丧失正常的生长调控功能，导致细胞的异常生长及分化而发生的。因此，从本质上讲恶性肿瘤是一种基因病。随着人类基因组学研究的不断深入，1939年有研究者提出了表观遗传学的概念。表观遗传学是一门研究DNA序列不变而其基因表达发生可遗传改变的遗传学分支学科[1]。其参与细胞调控的主要形式为：DNA核苷酸胞嘧啶的甲基化修饰、组蛋白修饰、非编码RNA干扰的调节等。目前科学家们认为，DNA甲基化和组蛋白修饰是最常见的两种关系到基因调控和细胞癌变的表观遗传学事件[2]。近年来已有大量的文献报道称，抑癌基因启动子区异常甲基化是肾癌发生的重要原因之一。抑癌基因启动子区的CpG岛发生甲基化后，会导致抑癌基因表达沉默失活，进而影响细胞正常的生长调控，细胞过度增殖最终导致肿瘤的发生[3]。国外已有报道称，抑癌基因的异常甲基化可视为一种有效诊断癌症的分子标记物。同时有研究发现，体外给予去甲基化药物后能够改变一些恶性肿瘤的病理生理学行为。这表明抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化状态与恶性肿瘤的发生有关，给予相应的去甲基化治疗，去除其CpG岛的异常甲基化状态具有治疗恶性肿瘤的潜能[4]。

DACT2基因位于人类染色体6q27。近年来，众多研究表明，DACT2基因在肝癌、肺癌、食管鳞状癌及乳头状甲状腺癌等许多癌症中均表达下调[5-9]。同时DACT2基因启动子区高度甲基化也是引起甲状腺乳头状癌发生转移的重要原因之一[7]。本研究结果表明，在59例RCC患者的3种不同组织中，其RCC组织的DACT2基因启动子区甲基化的发生率明显高于癌旁组织和正常肾组织。同时发现，RCC组织中DACT2基因mRNA的相对表达水平低于癌旁组织和正常肾组织。进一步比较发现，发生甲基化的RCC组织中DACT2基因mRNA的相对表达水平低于未发生甲基化的RCC组织。进一步研究发现，在RCC组织中DACT2基因的高甲基化率与β-catenin蛋白在细胞质中的高表达呈明显正相关。由此推断DACT2可能通过β-catenin起作用，β-catenin功能异常是导致细胞向癌变方向发展的原因之一。

综上所述，本研究显示DACT2基因启动子区异常甲基化可能会导致DACT2基因的表达下降，且二者的发生均与RCC的发生有关，但二者发生与RCC的临床进展未见明显相关。笔者认为可以进一步研究给予去甲基化药物物后，RCC细胞系中DACT2基因表达的恢复情况及RCC细胞系的变化情况，以期进一步探讨DACT2基因与RCC发生、发展的关系，为RCC的发病机制提供更深入的理论依据。同时，为RCC的早期诊断与治疗提供一个可能的生物学标志。

[1]Baylin SB，Ohm JE．Epigenetic gene silencing in cancer - a mechanism for early oncogenic pathway addiction?[J]．Nat Rev Cancer，2006，6(2)：107-116.

[2]Jones PA，Baylin SB．The fundamental role of epigenetic events in cancer[J]．Nat Rev Genet，2002，3(6)：415-428.

[3]Jones PA，Takai D．The role of DNA methylation in mammalian epigenetics[J]．Science，2001，293(5532)：1068-1070.

[4]Cooney CA，Dave AA，Wolff GL．Maternal methyl supplements in mice affect epigenetic variation and DNA methylation of offspring[J]．J Nutr，2002，132(8 Suppl)：S2393-2400．

[5]Jia Y，Yang Y，Brock MV，et al．Epigenetic regulation of DACT2,a key component of the Wnt signalling pathway in human lung cancer[J]．J Pathol，2013，230(2)：194-204.

[6]Wang S，Dong Y，Zhang Y，et al．DACT2 is a functional tumor suppressor through inhibiting Wnt/β-catenin pathway and associated with poor survival in colon cancer[J]．Oncogene，2015，34(20)：2575-2585.

[7]Zhao Z，Herman JG，Brock MV，et al．Methylation of DACT2 promotes papillary thyroid cancer metastasis by activating Wnt signaling[J]．PLoS One，2014，9(11)：e112336.

[8]Yu Y，Yan W，Liu X，et al．DACT2 is frequently methylated in human gastric cancer and methylation of DACT2 activated Wnt signaling[J]．Am J Cancer Res，2014，4(6)：710-724.

[9]Hou J，Liao LD，Xie YM，et al．DACT2 is a candidate tumor suppressor and prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma[J]．Cancer Prev Res(Phila)，2013，6(8)：791-800.

DACT2 gene promoter area methylation status and mRNA expression in renal cell carcinoma

FanBo，QiPan，ZhangAili△，ZhaoZhihong，NiXiaochen，LiuBin，MaYongliang，RenZongtao

(DepartmentofUrologySurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)

Objective To explore the role of the DACT2 gene in the occurrence and development of renal cell carcinoma(RCC).Methods The samples of RCC tissues and corresponding tumor-adjacent tissues after radical operation and normal kidney tissues were collected.The methylation specific PCR (MSP) and real time fluorescence reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) methods were adopted to detect the methylation status and mRNA expression of DACT2.The streptavidin-peroxidase (SP) method labeled by immunohistochemistry peroxidase was used to examine the expression of β-catenin protein.Then the relationship between DACT2 gene methylation status and mRNA expression with the clinicopathologic characteristics was analyzed.The relationship between DACT2 gene methylation with mRNA and β-catenin expression was analysed,as well.Results The DACT2 mRNA relative expression level in RCC tissues was 0.427±0.025,which was significantly lower than (0.801±0.047) in tumor-adjacent tissues and (0.872±0.022) in normal tissue,the positive rate of DACT2 gene methylation in RCC tissues was 45.76%,which was significantly higher than 6.78% in tumor-adjacent tissues and 5.08% in normal tissues,the difference was statistically significant (P<0.05),while the difference between tumor-adjacent tissues and normal tissues had no statistical significance (P>0.05).The DACT2 gene mRNA expression level in RCC tissues and promoter area methylation occurrence rate had no obvious correlation with the clinical data such as patients age,gender,tumor size,clinical stage and Fuhrman grade (P>0.05).The DACT2 gene mRNA relative level in the methylation group was lower than that in the non-methylation group,the difference was statistically significant (P<0.05).The expression rate of β-catenin protein in cytoplasma in RCC tissues was higher than that in the tumor-adjacent tissues and normal tissues,the difference was statistically significant (P<0.05),moreover,DACT2 gen methylation had a positive correlation with β-catenin protein expression (r=0.324，P=0.012).Conclusion The decrease of DACT2 gene promoter area methylation and mRNA relative expression level may participate in the RCC occurrence,but has no relationship with RCC clinical progression.Methylation occurred in DACT2 gene promoter area may be one of reasons causing mRNA relative expression decrase.DACT2 gene methylation occurrence in RCC tissue might be related to the high expression of β-catenin.

kidney neoplasms；DACT2；promoter；methylation；RNA，messenger

樊博(1983-)，主治医师，硕士，主要从事泌尿系肿瘤方面的研究。

△通信作者，E-mail：z13930409899@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.21.005

R692.6

A

1671-8348(2017)21-2895-03

2017-02-25

2017-04-30)