高效液相色谱-串联质谱法测定池塘沉积物中氯霉素残留

张素青, 陈永平, 李春青, 高丽娜,李连庆, 时文博, 李兆千, 张丹娜

(农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(天津)， 天津 300221 )



高效液相色谱-串联质谱法测定池塘沉积物中氯霉素残留

张素青, 陈永平*, 李春青, 高丽娜,李连庆, 时文博, 李兆千, 张丹娜

(农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(天津)， 天津 300221 )

[目的]建立一种使用液相色谱-串联质谱联用仪快速准确检测池塘沉积物中痕量氯霉素残留的方法，为水产品中氯霉素污染来源的排查提供技术支持。[方法]底泥经润湿后，经乙酸乙酯水饱和溶液提取，Sep-PaK C18固相萃取柱净化，Shim-Pack XR-ODS色谱柱分离，采用甲醇和水为流动相，并用梯度洗脱对待测物进行分离，以氘代氯霉素(氯霉素-D5)为内标，采用负离子扫描，多反应监测模式(MRM)，定性离子对m/z为321→152.0，256.8，定量离子对m/z为 321→152.0。[结果]氯霉素类药物在0.5～10.0 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.99，本方法的检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。3个加标水平(0.5、1.0和5.0 μg/kg) 的平均回收率为90.1%～96.6%，相对标准偏差为2.4%～7.0%。[结论]实验结果符合氯霉素药物残留检测的相关法规要求，适用于淡水池塘沉积物中氯霉素残留的定性定量检测。[中国渔业质量与标准，2017,7(4):14-20]

高效液相色谱-串联质谱；池塘沉积物；氯霉素；残留量

氯霉素(chloramphenicol)是一种广谱抗生素，对需氧、厌氧菌以及衣原体、支原体、立克次体等均有效。由于价格便宜且效果显著，曾被用于畜禽及水产动物的疾病治疗和预防。但是，氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，容易造成再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症和灰婴综合征等[1]。为保障动物源食品安全，许多国家和地区都对其做出了严格规定，严禁氯霉素在食用动物上使用。欧盟规定动物源食品中氯霉素残留的最低执法限量(MRPL)为0.3 μg/kg[2]，中国农业部235号公告中将氯霉素列为禁用药物[3]。尽管中国已经对此药物的使用做出了明确的禁用规定，但在实际生产中仍有少数养殖者在养殖过程中违规使用氯霉素[4]。氯霉素化学性质稳定，在环境水体中难以降解，属于持久性污染物[5]，在水产品中的残留可通过食物链进入人体。若在池塘中长期大量使用氯霉素，会有相当部分的氯霉素直接散失到水环境中，积累于沉积物，从而造成水产养殖环境污染[6-7]。而且，当受污染的淡水池塘进行再次养殖生产时，底泥中的氯霉素会不断向水体进行缓慢释放，成为其二次污染的主要来源。因此评估养殖池塘沉积物中的氯霉素药物残留状况，建立相应的检测方法，对于水产品中氯霉素污染来源的排查具有积极的意义。

氯霉素的检测方法主要有酶联免疫法[8]、气相色谱法(GC)[9-10]、液相色谱法(HPLC)[11]、气相色谱-质谱法(GC- MS)[12-13]及液相色谱-串联质谱法(LC-MS /MS)[14-16]。上述检测方法都有各自的优势和不足，酶联免疫法虽然便捷快速，但容易出现假阳性；HPLC法虽然操作简便，但仅靠保留时间定性，如果基线出峰有些偏离，容易出现定性不准确，不能满足残留检测要求；GC和GC-MS方法则需对样品进行衍生化处理，过程很复杂。LC-MS/MS法具有快速、灵敏度高、专一性好、不受噪声干扰等特点，尤其是通过多反应监测模式(MRM)能进一步提高检测的灵敏度和选择性，大大降低了检出限，并减少假阳性的出现。

目前，对于鱼塘沉积物中氯霉素的含量分析进行研究的不多[17-18]。养殖池塘沉积物成份复杂，杂质多，对分析干扰大，对样品的净化要求较高。本研究将超声提取、液-液萃取(LPE)、液-固萃取(SPE)技术结合起来对样品进行前处理，结合高效液相色谱-串联质谱法，建立养殖池塘沉积物痕量氯霉素的分析方法。同时运用该方法调查了天津部分地区养殖池塘沉积物样品中氯霉素的残留现状，以期从养殖源头监控其污染情况 ，为排查污染来源及评价生态环境对健康养殖的影响提供有力的技术支持。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

色谱柱为Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75 mm×2.0 mm，5 μm)；4000 Q Trap液质-质联用仪(AB生物公司)；电子天平BT125D (德国赛多利斯)；SIR4 漩涡混合器(IKA公司)；超声波清洗器无锡雷士Z-500；Sigma 3k15冷冻离心机。

氯霉素标准品含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司)；氯霉素-D5内标物含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙酸乙酯、正己烷为色谱纯(德国默克公司)； 氨水为分析纯(国药公司)；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准工作液的配制

准确称取适量标准品氯霉素，用甲醇溶解定容，配成100 μg/mL标准储备液；准确称取适量标准品氯霉素-D5，用甲醇溶解定容，配成100 μg/mL标准储备液，-20 ℃保存备用。

移取适量100 μg/mL氯霉素标准储备液，用甲醇进行稀释，分别配制成0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 和10.0 ng/mL的一系列标准工作液，4 ℃保存备用。

1.2.2 样品前处理

1)样品制备：从池塘取来的沉积物预先除去杂质，在阴凉处自然风干。

2)提取：称取样品5.00 g置50 mL离心管中，加入2 mL水润湿，加入500 μL质量浓度为10.0 ng/mL的氯霉素内标溶液、5 mL乙腈及5 mL 4%氯化钠溶液，漩涡振荡2 min，超声萃取20 min后，静置10 min，15 000 r/min离心10 min，移取上清液至另一50 mL 离心管中；重复提取1次，合并2次提取液。

3)液-液萃取净化：在提取液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5 mL，漩涡振荡2 min，5 000 r /min离心10 min，上层液转移到15 mL离心管中，重复提取1次，将上述所得提取液用氮气吹干，用乙腈-水(5∶95，V/V)溶液3 mL 溶解，得到备用液。

4)液-固萃取净化：将固相萃取柱依次用10 mL甲醇、10 mL水预洗，然后取上述备用液过柱，用 5 mL水洗柱，用5 mL甲醇水(50∶50，V/V)溶液洗脱，以1 mL /min的速度将样品洗脱入转15 mL 离心管中。在洗脱液中加入水饱和乙酸乙酯溶液5 mL，涡旋振荡2 min，5 000 r /min，离心5 min，取上层液，重复提取1次，合并提取液氮气吹干。用1 mL 甲醇水(50∶50，V/V)溶液溶解残留物，旋涡后经0.22 μm微孔滤膜过滤后，用液相色谱-串联质联用仪上机测定。

1.2.3 液相色谱条件

采用Shim-Pack XR-ODS色谱柱，柱温40 ℃，流动相A为水，B为甲醇，流速为0.30 mL/min，进样量5μL，采用梯度洗脱，见表1。

表1 流动相梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution of mobile phase

注：流动相A为水，流动相B为甲醇。

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；多反应监测(MRM)负离子模式；电喷雾电压为-4 500 V；气帘气为20 Psi；辅助气为50 Psi；去簇电压为-80 V，碰撞电压为-10 V，离子源温度为500 ℃。化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示。

1.2.5 标准曲线的绘制

在0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和10.0 ng/mL梯度标准品溶液中分别加入5.0 ng氯霉素-D5内标，自动进样分析，以目标物质与对应内标的峰面积比为纵坐标，目标物质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 检出限与定量限确定

取空白沉积物添加氯霉素标准工作液和内标溶液按1.2.2方法进行样品前处理，按1.2.3液相色谱条件和1.2.4质谱条件进样分析，每个浓度做6个重复。

1.2.7 方法回收率与精密度测定

取池塘空白沉积物样品进行3个水平的添加，氯霉素的添加水平分别为0.5、1.0和5.0 μg/kg，每个水平做6个平行样品，计算回收率和精密度。

表2 化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数Tab.2 Multi reaction monitoring ion pair and parameters of mass spectra

注：其中*为定量离子。

2 结果与分析

2.1 检测方法的建立

氯霉素中羟基官能团可带负电荷，选用(ESI-)离子化模式可以提供比正离子方式(ESI+)更多的碎片信息，且灵敏度大幅提高。本方法氯霉素及氯霉素-D5的母离子分别为m/z321.1和326.1。以多反应监测(MRM)模式对目标物进行定性定量分析，选择丰度最强、无干扰的监测离子对321.1/152.0、326.1/157.1分别用于氯霉素及氯霉素-D5的目标物定量，其他离子对则分别用于辅助定性。如图1所示，将0.5 mg/L的氯霉素标准溶液及氯霉素-D5内标液利用流动注射泵以10 μL/min速度连续进样，在负离子模式下进行母离子全扫描。

图1 氯霉素及氘代氯霉素(氯霉素-D5)特征离子质量色谱图Fig.1 Characteristic ion mass chromatogram of chloramphenicol and D5-chloramphenicol

图2 氯霉素特征离子质谱图Fig.2 Characteristic ion mass spectrometry of chloramphenicol

2.2 方法的线性、检出限和定量限

在上述仪器条件下测定，以氯霉素及其内标物的物质浓度为横坐标，以其对应的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程，方法检出限及定量限见表3。

试样中氯霉素色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比，变化范围在±2.5%。本方法的线性范围在0.5～10 ng/mL，按3倍信噪比计算得该方法检出限为0.1 μg/kg，以10倍信噪比计算得该方法的定量限为0.3 μg/kg。

2.3 方法的回收率和精密度

氯霉素3个加标水平(0.5 、1.0和5.0 μg/kg)的平均回收率为90.1%～96.6%，相对标准偏差为2.4%～7.0%(表4)。

表3 池塘沉积物中氯霉素残留检测的线性范围、标准曲线、检出限和定量限Tab.3 Linear range, linear equation limit of detection and quantification of chloramphenicol in sediment

表4 底泥中氯霉素加标回收率和精密度Tab.4 Recoveries and relative standard deviation of the detection method for chloramphenicol in sediment

2.4 实际样品的测定

在天津市某区养殖基地随机采集10份沉积物样本，使用本方法进行提取后测定，发现1份养殖池塘中沉积物样本的氯霉素含量为1.0 μg/kg，其他样本均未检出。池塘沉积物空白样品氯霉素特征离子质量色谱图如图3所示，池塘沉积物阳性样品氯霉素特征离子质量色谱图(1.0 μg/kg)如图4所示。

3 结论

本研究建立了使用液相色谱-串联质谱联用仪测定养殖池塘沉积物中氯霉素残留的方法。该方法检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg，在 0.5～10.0 ng/mL范围线性关系良好，回收率范围为90.1%～96.6% ，相对标准偏差小于7%。本方法满足养殖池塘沉积物中氯霉素残留的检测要求，为检测养殖池塘沉积物中氯霉素提供技术支持。

图3 池塘沉积物空白样品氯霉素特征离子质量色谱图Fig.3 Chloramphenicol characteristic ion mass chromatogram of blank sample in pond sediment

图4 池塘沉积物阳性样品氯霉素特征离子质量色谱图(1 μg·kg-1)Fig.4 Chloramphenicol characteristic ion mass chromatogram of positive samples in pond sediment

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《中国渔业质量与标准》征订启事

《中国渔业质量与标准》是由农业部主管、中国水产科学研究院主办的学术刊物。

本刊宗旨是：刊载我国渔业领域质量安全和标准等方面的政策法规、技术资讯及研究成果，搭建渔业质量与标准工作沟通交流的平台，提高渔业质量和标准水平，促进渔业可持续发展。主要收录水产品质量安全研究和标准研究等方面的具有创新性和学术价值的研究论文、综述等。内设栏目包括质量安全监管、标准研究、风险评估、检验与检测、质量认证、环境质量、生产过程质量、产品质量、病害与渔药等。

本刊现为双月刊，大16开，每逢单月出版，自办发行，每期定价18元，全年价108元，加邮费全年定价共计120元。凡需订阅本刊者，可直接与编辑部联系征订。

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Determination of chloramphenicol residue in pond sediment by UPLC-MS/MS

ZHANG Suqing, CHEN Yongping*, LI Chunqing, GAO Lina, LI Lianqing,Shi Wenbo， LI Zhaoqian, ZHANG Danna

(Quality of Fishery Environment and Aquatic Products Supervision and Testing (Tianjin), Ministry of Agriculture,Tianjin 300221 China)

[Objectives] This study is aim to establish a rapid and accurate method for trace analysis of chloramphenicol residue in pond sediment. It will provide methodological guidance for investigating chloramphenicol pollution in aquatic products. [Methods] The mud samples were soaked and extracted using water saturated ethyl acetate solution by liquid-liquid extraction method. After extraction, the samples were purified by Sep-Pak C18and separated by Shim-Pack XR-ODS columns with a mobile phase of methanol and water using gradient elution. Chloramphenicol-D5 was used as internal reference standard and multiple reaction monitoring combined with negative-ion scans was performed. Characteristic transition reaction fragmentsm/z: 321→152.0, 256.8 andm/z: 321→152.0 were tested for the qualitative ion pair and quantitative ion pair of chloramphenicol, respectively. [Results] The dosage of chloramphenicol residues (0.5～10.0 ng/mL) fit well on the calibration curve of CPS intensity. The correlation coefficient was above 0.99．The limit of detection and quantification for chloramphenicol were 0.1 μg/kg and 0.3 μg/kg, respectively. The average recoveries of chloramphenicol at the levels of 0.5, 1.0, and 5.0 μg/kg were ranged from 90.1% to 96.6%．The relative standard deviation was 2.4% ～ 7.0%. [Conclusions] The test results confirmed totally to the requirements of related regulation and this method is suitable for the qualitative and quantitative detection of chloramphenicol residues in pond sediment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(4):14-20]

UPLC-MS/MS; pond sediment; chloramphenicol; residue

CHEN Yongping,jiamu008@163.com

2017-01-09；接收日期：2017-03-05

天津市科技支撑计划重点项目(14ZCZDNC00012)

张素青(1966-)，女，学士，正高级工程师，研究方向为渔业环境及水产品质量安全，s.q.zhang1@163．com 通信作者：陈永平，高级工程师，研究方向为水产品药物代谢动力学与质量安全，jiamu008@163.com

S91

A

2095-1833(2017)04-0014-07