不同干燥条件连翘叶茶有效成分含量比较

麻景梅 王迎春 李琛 王梦 郑倩 牛丽颖

摘要：目的 比較不同干燥条件下连翘叶茶中总黄酮、连翘酯苷A和连翘苷含量，确定连翘叶茶最佳干燥方式。方法 采用紫外分光光度法，以亚硝酸钠-三氯化铝-氢氧化钠溶液体系为显色剂，在波长500 nm处测定总黄酮含量；采用HPLC同时测定连翘酯苷A和连翘苷含量，色谱柱为Diamosil C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.4%乙酸水溶液，梯度洗脱，检测波长277 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min。结果 不同干燥条件连翘叶茶中总黄酮含量基本相同；不同干燥条件连翘叶茶中连翘酯苷A和连翘苷含量顺序为：通风阴干干燥>真空干燥>鼓风干燥。结论 不同干燥条件对连翘叶茶中总黄酮含量无明显影响，对连翘酯苷A和连翘苷的含量影响较大，通风阴干比鼓风干燥和真空干燥更有利于连翘酯苷A和连翘苷成分的保存。

关键词：连翘叶茶；总黄酮；连翘酯苷A；连翘苷；紫外分光光度法；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.017

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0076-04

Comparison of Effects of Different Drying Methods on Contents of Effective Components of Forsythiae Fructus Leaves Tea MA Jing-mei1，2， WANG Ying-chun1，2， LI Chen1，2， WANG Meng1，2， ZHENG Qian3， NIU Li-ying1，2 （1. Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050091， China； 2. Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology; Research Center， Shijiazhuang 050091， China； 3. Shijiazhuang Traditional Chinese Medicine Hospital， Shijiazhuang 050001， China）

Abstract： Objective To compare the contents of total flavonoids， forsythoside A and phillyrin in Forsythiae Fructus leaves tea under different drying conditions； To determine the best drying method for Forsythiae Fructus leaves tea. Methods With the sodium nitrite-aluminum trichloride-sodium hydroxide solution as color reagent， total flavonoids in forsythiae Fructus leaves tea were determined by UV spectrophotometry at the wavelength of 500 nm. HPLC was used to determine the contents of forsythiaside A and phillyrin. The analysis was performed on a Diamosil C18 （2） column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）； the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.4% acetic acid with gradient elution； the detection wavelength was set at 277 nm； the flow rate was 1.0 mL/min at column temperature of 30 ℃. Results The content of total flavonoids of Forsythiae Fructus leaves tea under different drying conditions was basically the same； the sequence of the contents of forsythoside A and Forsythin of Forsythiae Fructus leaves tea under different drying conditions was： ventilated drying > vacuum drying > blast drying. Conclusion Different drying conditions have no effect on the contents of total flavonoids in Forsythiae Fructus leaves tea， but have obvious effects on the contents of forsythiaside A and phillyrin. Ventilation shade is better than blast drying and vacuum drying for preverence of forsythiaside A and forsythin.

Key words： Forsythiae Fructus leaves tea； total flavonoids； forsythoside A； phillyrin； UVspectrophotometry； HPLC

连翘叶为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥叶，连翘的入药部位为其果实，其叶不作为药用。近年来研究发现，连翘叶化学成分

基金项目：河北省食品药品监督管理局普通项目（PT2014056）；河北省高等学校科学技术研究重点项目（ZD2015001）

通讯作者：牛丽颖，E-mail：niuliyingyy@163.com

组成与其果实有极大相似性，且有效成分连翘酯苷A和连翘苷的含量高于连翘果实[1-2]。现代药理研究表明，连翘叶具有抗炎、抗菌、抗衰老、保护肝脏、调节免疫功能等作用[3]。民间有将连翘叶制成茶饮用的习惯，将连翘叶开发成茶品，对连翘资源的综合利用有重要意义。茶叶制作工艺中尤为重要的环节是干燥，常见的干燥方式主要有烘干、阴干等。为研究不同干燥方式对连翘叶中有效成分的影响，本试验采用紫外分光光度法测定不同干燥条件连翘叶茶中总黄酮的含量，并采用HPLC同时测定连翘酯苷A和连翘苷的含量，为连翘叶茶的制作工艺提供依据。

1 仪器与试药

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析）；LC-15C高效液相色谱仪（日本岛津），SPD-15C型紫外检测器，SIL-10AF自动进样器，CTO-15C柱温箱，LC solution色谱工作站；TB-215D、BSA224S- CW电子天平（赛多利斯）。

芦丁对照品（批号100080-201408）、连翘酯苷A对照品（批号111810-201405）、连翘苷对照品（批号110821-201213），中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。连翘叶茶样品（自制），常温通风阴干、鼓风干燥、真空干燥样品均为同一批连翘叶原料加工，连翘叶均来源于河北中医学院药用植物园，经河北中医学院中药鉴定教研室侯芳洁鉴定为木犀科连翘属植物连翘的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，振摇溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含芦丁0.201 2 mg的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备及显色方法 取连翘叶茶粉末（过80目筛）约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加70%乙醇20 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。精确吸取1.0 mL供试品溶液，置25 mL量瓶中，加水至8 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%三氯化铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL、再加水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，在500 nm波长处测定吸收度[4-6]。

2.1.3 芦丁标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液2、3、4、6、8 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至8 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%三氯化铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，在500 nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=10.055 9X+0.064 1（r=0.999 6），线性范围为0.016 0～0.064 4 mg/mL。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液5 mL，连续进样测定6次，记录吸光度。结果芦丁吸光度的RSD=1.21%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密称取同一连翘叶茶样品（常温阴干24 h），按“2.1.2”项下制备方法供試品溶液，显色后分别于放置0、10、20、30、45、60 min进样测定，记录吸光度。结果吸光度RSD=2.64%，表明供试品溶液在60 min内基本稳定。

2.1.6 重复性试验 取同一连翘叶茶样品（常温阴干24 h）6份，精密称定。按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，显色后测定，记录吸光度。结果吸光度RSD=1.77%，表明本方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 取已知含量的连翘叶茶样品（常温阴干24 h）适量，共6份，分别加入一定量的芦丁对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，显色后进样测定，记录吸光度，计算样品含量和加样回收率。结果平均加样回收率为100.02%，RSD=2.49%，表明本方法准确度良好，见表1。

2.1.8 样品含量测定 分别精密称取不同干燥工艺下连翘叶茶0.5 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并进行显色，测定吸光度，由标准曲线回归方程可得总黄酮的质量浓度并计算含量，结果见表2。

2.2 连翘酯苷A和连翘苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamosil C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；以乙腈为流动相A，0.4%乙酸水溶液为流动相B，按表3进行梯度洗脱；流速1.0 mL/min；检测波长：277 nm；进样量：10 ?L；柱温：30 ℃。理论塔板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000，按连翘苷峰计算不低于3000[7-9]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取连翘酯苷A、连翘苷对照品适量，置量瓶中，加70%甲醇，制得0.536 1 mg/mL连翘酯苷A和0.104 8 mg/mL连翘苷混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，称取约0.20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、4、6、10、20 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，连翘酯苷A和连翘苷进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果回归方程分别为：连翘酯苷A Y=1.546 1×105X+2.604 1×104，r=0.999 8；连翘苷Y=7.359 6×105X+3.019 0×104，r=0.999 7。连翘酯苷A和连翘苷进样量分别在1.072 2～10.722 0 ?g和0.209 6～2.096 0 ?g范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液10 ?L，连续进样6次，测定连翘酯苷A和连翘苷峰面积，其RSD分别为1.68%和1.01%，表明仪器的精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h进样，测定连翘酯苷A和连翘苷的峰面积，结果RSD分别为1.58%和1.32%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 取同一连翘叶茶样品（常温阴干24 h），精密称定，平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果连翘叶茶中连翘酯苷A和连翘苷的平均含量分别为27.30 mg/g和7.28 mg/g，RSD分别为1.30%和1.51%，表明该方法的重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的连翘叶茶（常温阴干24 h），精密称定，平行6份，分别按样品中含量∶对照品加入量大致1∶1比例加入一定量的对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分的加样回收率及RSD。结果供试品溶液中连翘酯苷A及连翘苷的平均加样回收率分别为101.82%和101.97%，RSD分别为1.32%和1.95%，表明该方法的准确度良好，见表4、表5。

2.2.10 连翘叶茶样品含量测定 分别精密称取不同干燥条件下连翘叶茶（过80目筛）0.2 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见表6。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择

总黄酮供试品溶液的制备方法中，对提取方法（水浴回流法、超声提取法）、提取溶媒（60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇）进行单因素考察，最终确定以70%乙醇20 mL超声30 min提取连翘叶茶中总黄酮。

HPLC供试品溶液制备方法试验过程中，分别对连翘酯苷A和连翘苷的提取方法（水浴回流法、超声提取法）、提取溶媒（50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）、溶媒用量（25、50 mL）、提取时间（20、30 min、60 min）进行了单因素考察，经过比较，最终选择提取方法为70%甲醇25 mL，超声30 min。

3.2 色谱条件的选择

采用二极管阵列检测器，在波长190～390 nm对连翘酯苷A和连翘苷混合对照品溶液进行全波长扫描，二者在277 nm波长附近均有明显吸收；同时考察了流动相类型与梯度比例，确定以乙腈-0.4%乙酸为流动相梯度洗脱，结果各成分完全分离且峰形较好。

3.3 干燥方式的选择

干燥工艺所用连翘叶样品都经过炒青的方式杀青，蒸发了鲜叶部分水分，并起到杀酶保苷的作用。

黄酮类化合物是一类广泛存在于自然界、具有多种药理活性的天然多酚类化合物。通过对不同干燥方式连翘叶茶总黄酮含量测定的比较，发现常温通风阴干、真空干燥、鼓风干燥3种不同干燥方式对连翘叶茶中总黄酮含量无明显影响。

连翘酯苷A和连翘苷是连翘的主要有效成分，对不同干燥条件下连翘叶茶中2种成分的含量进行测定及对比研究发现，不同干燥条件对连翘叶茶中连翘酯苷A和连翘苷的含量有较大影响，其含量顺序为常温通风阴干>真空干燥>鼓风干燥。常温通风阴干时间长短对连翘酯苷A和连翘苷的含量无影响；真空干燥温度总体较低随着温度升高，二者含量无明显变化，鼓风干燥随着温度升高，二者含量都有所下降，尤其对连翘酯苷A含量影响较大。

本试验除了对有效成分含量进行对比，还发现常温通风阴干的连翘叶茶为青绿色，而真空干燥和鼓风干燥的连翘叶茶略显黑色，阴干的连翘叶茶外观色泽较真空干燥和鼓风干燥为好，并且阴干的连翘叶茶更加清香。结合连翘叶茶实际制作过程样品量较大的情况，为达到样品充分干燥的目的，考虑选择连翘叶茶经炒青后的干燥方式为常温通风阴干48 h。

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（收稿日期：2016-11-14）

（修回日期：2016-12-08；编辑：陈静）