FasL和Caspase-8蛋白表达及Caspase-8基因甲基化在非小细胞肺癌中的应用价值研究

叶艺旺，乌 达，刘继先，吴 昊

（北京大学深圳医院，广东 深圳 518036）

·实验研究·

FasL和Caspase-8蛋白表达及Caspase-8基因甲基化在非小细胞肺癌中的应用价值研究

叶艺旺，乌 达△，刘继先，吴 昊

（北京大学深圳医院，广东 深圳 518036）

目的 探讨FasL和Caspase－8蛋白表达及Caspase－8基因甲基化在非小细胞肺癌中的应用价值。方法 选取手术切除的非小细胞肺癌患者100例，均分别切除癌组织和癌旁组织（以肿瘤为中心6 cm为半径的肺组织），其中肺鳞癌55例，肺腺癌30例，肺腺鳞癌15例；低分化癌50例，中分化癌30例，高分化癌20例；伴有淋巴转移65例，无淋巴转移35例。另取正常肺内组织100例进行对照。采用免疫组化S－P染色法检测非小细胞肺癌标本FasL和Caspase－8蛋白表达；采用甲基化特异性聚合酶链式反应检测非小细胞肺癌组患者的Caspase－8基因甲基化状态。结果 FasL蛋白主要散布在肿瘤细胞浆液中，少数排列在细胞膜上；Caspase－8蛋白散布于细胞浆液中。在非小细胞肺癌中，FasL蛋白及Caspase－8蛋白存在不同程度的阳性表达，FasL蛋白阳性表达率明显大于癌旁组织和正常组织，在肺腺癌的阳性表达率明显大于鳞癌及腺鳞癌（P＜0.05），在低分化癌中的阳性表达率明显大于中分化癌及高分化癌，伴淋巴转移FasL蛋白阳性率大于非淋巴转移，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而Caspase－8蛋白阳性表达率明显小于癌旁组织和正常组织，在肺腺癌的阳性表达率明显小于鳞癌及腺鳞癌，在高分化癌中的阳性表达率明显大于中分化癌及低分化癌，伴淋巴转移Caspase－8蛋白阳性率低于非淋巴转移，差异均有统计学意义（P＜0.05）。癌组织Caspase－8基因甲基化率明显大于癌旁组织和正常组织，在肺腺癌的阳性表达率明显大于在鳞癌及腺鳞癌的阳性表达率，在低分化癌中的阳性表达率明显大于中分化癌及高分化癌，伴淋巴转移Caspase－8基因甲基化阳性率高于非淋巴转移，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 非小细胞肺癌中出现FasL蛋白高表达和Caspase－8基因高甲基化的变化，加快肺癌细胞与免疫细胞联合的速率，抑制免疫细胞的活性，致使肿瘤内部形成无免疫区域而促进肿瘤细胞的分裂和滋长，成为腺癌较易发生早期转移的重要原因。Caspase－8蛋白在鳞癌中表达增高，这是鳞癌预后较好的主要因素，也是判断非小细胞肺癌预后的重要指标之一。Caspase－8参与了非小细胞肺癌的演变，与非小细胞肺癌的发生、发展及转移有密切关系，作为非小细胞肺癌预后的重要指标，为临床对非小细胞肺癌进行综合性、针对性的治疗提供了重要理论依据。

FasL蛋白表达；Caspase－8蛋白表达；Caspase－8基因甲基化；非小细胞肺癌

近年来，肺癌的发病率高、死亡率高，已成为严重危害我国人民健康的恶性肿瘤[1－2]，而非小细胞肺癌占肺癌的80%～85%。恶性肿瘤的发生和发展与机体的免疫系统有直接关系，肿瘤宿主的免疫功能缺失，会加快肿瘤的滋长和分裂速度[3]。临床常将提高机体免疫功能、促进免疫细胞活性及加快肿瘤细胞凋亡速率归结为治疗肿瘤的三大有效方法[4－5]。有研究显示，细胞的凋亡主要通过线粒体途径及由细胞膜参与凋亡的死亡受体途径[6－7]。在后一种途径中，FasL发挥了重要作用，其能和Fas联合使其凋亡。以Caspase－8为核心的Caspase家族是凋亡过程中重要的催化剂，Caspase－8参与了凋亡反应的整个过程，发挥了不容小觑的作用[8]。另有研究显示，在肿瘤细胞滋长期间，DNA甲基化能作用于DNA和蛋白，并影响二者间的相互联系，破坏其组成，进而阻碍基因转录的速度[9－10]。本研究中通过对人体非小细胞肺癌各组织、类型、分化程度及伴随淋巴转移中FasL和Caspase－8蛋白的表达情况和Caspase－8基因甲基化状态进行研究，探究FasL和Caspase－8蛋白表达及Caspase－8基因甲基化在非小细胞肺癌中的应用价值，为临床指导治疗提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本选取：选取2015年1月至2016年4月我院确诊为非小细胞肺癌并行手术切除的患者100例，手术切除后立即进行标本采集，癌旁组织是以肿瘤为中心、6 cm为半径的肺组织。将标本随机分为2份，一份经液氮冷冻10min后置－80℃冰柜中储存；另一份以10%的福尔马林和石蜡包藏，连续切片后进行HE染色，遵照世界卫生组织（WHO）颁布的《肺肿瘤组织学分型》[11]对切片进行分类。100例患者中，男65例，女35例；年龄（59.4±10.3）岁；鳞癌55例，腺癌30例，腺鳞癌15例；低分化癌50例，中分化癌30例，高分化癌20例；伴有淋巴结转移65例，不伴淋巴结转移35例。同时取正常肺组织（距癌旁组织1 cm外）100例作为对照。

纳入标准[12]：入院前未进行针对性治疗；未进行免疫治疗；手术前进行头、胸等部位CT检查，排除癌细胞转移可能；依从性良好，并签署知情同意书；除癌组织外，其他部位均未发现癌细胞。

仪器与试剂：石蜡切片机（德国莱卡公司）；闭式自动脱水机，微量加样器及恒温水浴箱（上海医疗器械厂）；冰柜（西门子公司）；微波炉（美的公司）；离心管、台式恒温离心机及DNA热循环仪（Eppendorf公司）；紫外分光光度计（美国Beckman公司）等。兔抗人FasL单克隆抗体，兔抗人Caspase－8多克隆抗体，兔抗鼠IgG多克隆抗体，S－P免疫染色试剂盒，APES丙酮稀释液及DAB显色剂，均由上海田源生物技术有限公司生产；组织DNA提取试剂盒和Caspase－8引物及糖原均由上海生工生物工程有限公司生产；SSSI酶由纽英伦生物技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 FasL和Caspase－8蛋白表达检测

采用免疫组化S－P染色法。1）将免疫组化所需载玻片用洗涤液洗涤后，置弱酸中1 d，后用蒸馏水反复清洗，置75℃烤箱烘干[13]。2）将载玻片放入APES丙酮溶液（丙酮－蒸馏水＝1∶5）0.5min后再放入体积分数为100%的丙酮溶液中清洗3次，后将载玻片用蒸馏水清洗干净，常温干燥，密封保存。3）将盖玻片于弱酸中放置6 h后，先后用蒸馏水及无水乙醇清洗，常温干燥，密封保存。4）将石蜡中包藏的切片放进65℃烤箱内1 h，取出后立即置二甲苯中冷却，连续进行2次，每次持续10～15 min。最后用3种体积分数（100%，95%，75%）的乙醇对切片进行脱苯，再用蒸馏水清洗切片[14]。5）用体积分数为30%的过氧化氢与蒸馏水以 1∶10的比例制备溶液，于室温下孵育10min，再用蒸馏水连续清洗3次，后放入PBS溶液中5 min。6）将切片置枸橼酸钠弱酸溶液中，对其进行加热，待溶液沸腾后冷却，连续操作3次后用PBS缓冲液洗涤。7）滴加一抗：在切片上滴加兔抗人FasL单克隆抗体和兔抗人Caspase－8多克隆抗体稀释液，置4℃的冰箱12 h，然后将切片取出，置室温，用PBS清洗3次。8）滴加二抗：再滴加一定量的兔抗鼠IgG多克隆抗体，置 37.5℃的冰箱内 15～20 min，再用 PBS溶液冲洗3次，保留一抗与二抗相结合部分。9）滴加辣根过氧化物酶对链霉素抗生素蛋白进行标记，于室温下孵育10min，再用 PBS清洗 3次。10）滴加 DAB显色，用流水冲洗 10 min，再用苏木素进行轻度复染，脱水，用中性树胶封片，在高倍显微镜下进行观察。

1.2.2 组织标本DNA提取

1）取 50 mg组织碎块，置 2 mL离心管中，加入20μL ZZZ－1缓冲液和25μLOB蛋白酶，混匀后放入50℃恒温水浴锅中12 h，待离心管中液体完全裂解后，以10 000 r／min的速率离心1min，离心结束后取上清液置新的离心管中。2）向上清液离心管中加入220μL ZZ－2缓冲液漩涡混匀，置65℃水温箱中15min，再滴入与ZZ－2等量的无水乙醇，混均。3）将混合液导入装在收集试管上的Mu－Pu分离柱内，以8 000 r／min的速率离心1min，弃流出液和收集管；另取1支新的收集管，将柱子装在收集管内，滴入 DNA洗涤缓冲液（经720μL稀释），以8 000 r／min的速率离心1min，弃流出液和收集管；再取1支新的收集管，将柱子装在收集管内，滴入DNA洗涤缓冲液（经720μL稀释），以8 000 r／min的速率离心1min，弃流出液，再以12 000 r／min的速率高速离心2min。4）将柱子置小离心管中，用70℃的双蒸水进行预热，室温下放置5min后，以8 000 r／min的速率离心1min，最后将流出液脱出。取等量等温度的双蒸水置柱子中，下接小离心管，室温下放置5min后，以8 000 r／min的速率离心1 min，再将流出液脱出，将2次流出液混匀。5）取8μL DNA溶液，置600μL双蒸水中，测定260 nm与280 nm波长处的吸光度值，计算DNA浓度，再将DNA平均分成2份，分别置EP管内，于－20℃储存。

1.2.3 DNA的亚硫酸化修饰

向质量浓度为2 000 ng／L的DNA溶液中加入去离子水和3 mol／L NaOH 5.5μL，于42℃水浴中静置30 min，后加入30μL的10 mmol／L氢醌和510μL的3.9mol／L亚硫酸氢钠（NaHSO3），最后加入14.5μL去离子水至总体积为610μL。将上述液体混合均匀后离心，再滴入适量石蜡油，避光水浴中保存15 h。

1.2.4 DNA的纯化

1）将上述溶液去除油层，留下0.5 m L，加入1 mL纯化树脂摇晃均匀，将混合液倒入下接EP管的一次性注射针管内，塞进针管活塞使混合物透过滤过柱，让DNA黏附于树脂上。2）用相同方法使2mL异丙醇透过滤过柱并进行洗涤。3）滤过柱连接离心管，于室温下以13 000 r／min的速率离心2min，将树脂干燥。再将滤过柱与新的离心管连接，向滤过柱中加入60℃左右的超净水，以13 000 r／min的速率离心2min，洗脱DNA后，放入EP管内。4）加入5μL浓度为0.3mol／L的NaOH溶液和33μL的10mol／L乙酸胺，使溶液的pH提示为中性，后将溶液浓度浓缩至3 mol／L，加入1μL糖原，再注入3μL无水乙醇，置－20℃冰箱中静置12 h，使得DNA完全沉淀。5）以14 000 r／min的速率离心20min后取上清液，用75%乙醇清洗，再以12 000 r／min的速率离心5 min，将管壁液体去除后自然干燥，最后用30μL超净水悬浮 DNA，于 －20℃环境密封储存。6）Caspase－8甲基化引物及非甲基化引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.5 琼脂糖凝胶PCR产物的电泳

在微波炉中将 2%的琼脂糖凝胶溶解[15]，冷却至55℃后加入质量浓度为10 g／L的溴化乙锭，混匀后制成凝胶，待其完全凝固后置TBE缓冲液中电泳，另取5μL PCR扩增物置缓冲液中，按5∶1的比例充分混合，置2%琼脂糖凝胶孔中，电泳30min后用紫外线观察目标条带，摄影，记录。

1.3 结果评定标准

免疫组化S－P染色结果：用PBS代替一抗设为阴性空白对照，已知肺癌阳性表达淋巴细胞为阳性对照，FasL蛋白主要遍布在肿瘤细胞浆液中，少数排列在细胞膜上，而Caspase－8蛋白则分布于细胞浆液中，阳性显色呈棕黄色，依据肿瘤组织细胞的染色强度进行判断。若整张切片上无棕黄色细胞，且细胞数少于25%，则为阴性；若染色细胞数介于25%～50%，则为弱阳性；若染色细胞数介于50%～75%，则为阳性；若染色细胞数大于75%，则为强阳性。

甲基化性质：PCR扩增后，若出现甲基化引物扩增条带，则说明发生了甲基化，若无条带，则说明未发生甲基化；全部形成甲基化产物，称之为完全甲基化；除甲基化产物外还有剩余未甲基化的产物，称之为部分甲基化；若完全没有甲基化产物，则称之为无甲基化。本研究中将完全甲基化和部分甲基化均归为甲基化阳性。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 FasL和Caspase－8蛋白的表达

不同癌组织：FasL蛋白主要遍布肿瘤细胞浆液中，少数排列在细胞膜上，阳性表达率明显高于癌旁组织和正常肺组织；Caspase－8蛋白则散布于细胞浆液中，阳性表达率显著低于癌旁组织和正常肺组织。各组间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 非小细胞肺癌各组织中FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率s，%，n＝100）

表1 非小细胞肺癌各组织中FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率s，%，n＝100）

注：与癌组织比较，*P＜0.05；与癌旁组织比较，△P＜0.05。

不同癌组织类型：FasL蛋白在肺腺癌中的表达水平明显高于鳞癌和腺鳞癌，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Caspase－8蛋白在肺腺癌中的表达水平明显低于鳞癌和腺鳞癌，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 非小细胞肺癌各组织类型中FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率（s，%）

表2 非小细胞肺癌各组织类型中FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率（s，%）

注：与腺癌比较，*P＜0.05；与鳞癌比较，△P＜0.05。

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不同癌分化程度：FasL蛋白在低分化癌中的表达水平最高，显著高于中、高分化癌，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Caspase－8蛋白在低分化癌中的表达水平最低，显著低于中、高分化癌，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表3 非小细胞肺癌各分化程度中FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率（s，%）

表3 非小细胞肺癌各分化程度中FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率（s，%）

注：与低分化组比较，*P＜0.05；与中分化组比较，△P＜0.05。

不同转移情况：转移淋巴组织中FasL蛋白阳性表达率高于无转移淋巴组织，前者中Caspase－8蛋白阳性表达率低于后者，组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表4。

表4 非小细胞肺癌淋巴组织中FasL和Caspase－8蛋白表达情况（±s，%）

表4 非小细胞肺癌淋巴组织中FasL和Caspase－8蛋白表达情况（±s，%）

注：与淋巴结转移组比较，*P＜0.05。

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蛋白表达与肿瘤部位、性别和年龄的关系：中心型非小细胞肺癌中，FasL和Caspase－8蛋白阳性表达率均高于外周型非小细胞肺癌，但各组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。对非小细胞肺癌组织中FasL 和Caspase－8蛋白表达与患者性别和年龄之间的关系进行分析，各组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表5。

表5 非小细胞肺癌组织中FasL和Caspase－8蛋白表达与肿瘤部位、性别和年龄的关系（±s，%）

表5 非小细胞肺癌组织中FasL和Caspase－8蛋白表达与肿瘤部位、性别和年龄的关系（±s，%）

注：各组组内比较，*P＞0.05。

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2.2 Caspase－8基因甲基化的表达

不同癌组织：癌组织中Caspase－8基因甲基化率显著高于癌旁组织和正常肺组织，且癌组织和癌旁组织同正常肺组织相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表6。

不同癌组织类型：Caspase－8基因甲基化在腺癌中的表达率最高，明显高于鳞癌和腺鳞癌，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表7。

表6 非小细胞肺癌不同组织中Caspase－8基因甲基化表达情况（n＝100）

表7 非小细胞肺癌不同组织类型中Caspase－8基因甲基化表达情况

不同癌分化程度：低分化非小细胞肺癌Caspase－8基因甲基化率明显高于中分化及高分化非小细胞肺癌，组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表8。

表8 非小细胞肺癌各分化程度中Caspase－8基因甲基化表达情况

不同转移情况：伴有淋巴转移组织中 Caspase－8基因甲基化的表达率明显高于无淋巴转移组织，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表9。

表9 非小细胞肺癌淋巴组织中Caspase－8基因甲基化表达情况

淋巴组织中甲基化表达与肿瘤部位、性别和年龄的关系：中心型非小细胞肺癌Caspase－8基因甲基化的表达率低于外周型非小细胞肺癌，但组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。对非小细胞肺癌组织中Caspase－8基因甲基化的表达率与患者性别和年龄之间的关系进行比较，各组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表10。

3 讨论

3.1 非小细胞肺癌中FasL和Caspase－8蛋白的表达

FasL蛋白的检测结果表明，非小细胞肺癌组织的阳性表达明显高于正常组织和癌旁组织，其中以正常组织的表达率最低（P＜0.05）。另外，FasL在肺腺癌、肺鳞癌及肺腺鳞癌的表达，以肺腺癌为最高，其次为肺鳞癌及肺腺鳞癌（P＜0.05），表明在不同组织类型的癌症中FasL存在表达差异。非小细胞肺癌的不同分化阶段，FasL蛋白在低分化癌细胞的表达最高，在中分化及高分化癌细胞中的表达有所降低（P＜0.05），说明在不同分化阶段，FasL的表达亦有差异性。非小细胞肺癌淋巴组织检测结果表明，FasL蛋白在伴有淋巴转移组的表达明显高于无淋巴转移组（P＜0.05）。对Caspase－8蛋白的检测结果显示，在非小细胞肺癌的阳性表达明显低于正常组织和癌旁组织（P＜0.05），在肺腺癌、鳞癌及腺鳞癌的表达，以肺腺癌为最低，其次为肺腺鳞癌及肺鳞癌（P＜0.05），同时Caspase－8蛋白在高分化癌细胞的表达最高，在中分化及低分化癌细胞中的表达有所降低（P＜0.05），Caspase－8蛋白在伴有淋巴转移组的表达低于于无淋巴转移组（P＜0.05）。由表5可见，非小细胞肺癌肿瘤的发生部位及年龄、性别等一线资料与 FasL和 Caspase－8蛋白的表达关系不明显（P＞0.05）。

表10 非小细胞肺癌淋巴组织中Caspase－8基因甲基化表达与肿瘤部位、性别和年龄的关系

研究结果显示，FasL蛋白在肺腺癌中的表达率最高，这也是肺腺癌易早期转移且病情最恶劣的主要原因[16]。肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞的无限增殖、过度转移密切相关，当机体免疫细胞对肿瘤细胞的约束力受到控制，肿瘤细胞无法正常凋亡时，癌基因会被激活并过度表达，最终加快了癌症的恶化速度。研究中发现，结合淋巴转移组的FasL蛋白表达明显高于无淋巴转移组，说明FasL参与了肿瘤细胞转移的全过程，加快其转移速度，帮助肿瘤细胞侵入机体淋巴等免疫系统，诱导靶器官细胞凋零，为转移的肿瘤细胞制造了良好的滋长环境[17]。由此可见，非小细胞肺癌FasL蛋白表达与肿瘤转移和恶化的关系不容小觑。与FasL的表达恰好相反，Caspase－8蛋白的检测结果显示，在非小细胞肺癌的阳性表达明显低于正常组织和癌旁组织，同时在低分化的癌组织中亦有较低的表达率，由此推断，非小细胞肺癌的恶化与Caspase－8蛋白失表达密切相关。Caspase－8蛋白在伴有淋巴转移组的相对低表达，对非小细胞肺癌的恶化起到了负面的推动作用。本研究结果显示，Caspase－8蛋白在肺鳞癌的高表达率也恰当地解释了肺鳞癌患者预后优于腺癌和鳞癌的原因。另有研究显示，利用免疫组化法对宫颈癌切片进行检测发现，Caspase－8蛋白在宫颈癌中的表达程度明显低于正常宫颈组织，随着宫颈癌病理检测分级的升高，Caspase－8蛋白的表达程度却随之降低[18]。由此推断，Caspase－8蛋白在肿瘤中的失表达抑制了肿瘤细胞的凋亡，间接地加快了肿瘤细胞的分裂增生，促进了肿瘤的进展。

综上所述，在非小细胞肺癌的发生、发展过程中，贯穿其中的是FasL蛋白和Caspase－8蛋白的表达与失表达。在肿瘤免疫细胞作用下，促使FasL蛋白的表达不断升高，相反，Caspase－8蛋白的表达却不断降低。在肿瘤恶化过程中，FasL蛋白的高表达进一步打乱了细胞的内循环，延缓肿瘤细胞的凋亡，同时压制Caspase－8的表达，恶性循环下，最终FasL蛋白的高表达占据了主导地位，这也促使肿瘤细胞最大限度地逃避了机体免疫细胞的噬杀，从而导致了癌细胞的扩散。临床，可根据检测FasL蛋白与Caspase－8蛋白的表达程度，对肿瘤的发生、发展程度和预后转归进行相应推测。

3.2 非小细胞肺癌中Caspase－8基因甲基化的应用

以人为代表的哺乳动物体内均发生DNA甲基化，所谓甲基化即指以 S－腺苷甲硫氨酸为基本供体，以甲基转移酶为催化剂，使发生复制反应的DNA在CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共价键上形成1个甲基[19]。CpG通常有2种存在形式：一种存在于哺乳动物的DNA中，呈散在形式分布；另一种以CpG岛的形式存在。人体内的DNA甲基化是构成染色质的重要组成条件，其模式能通过模拟或遗传方式而保持多维有序的存在[20]。从胚胎形成、细胞增殖、分裂、肿瘤的形成到机体的衰老，DNA甲基化在整个生长过程中占据了不可替代的位置[21]。甲基化在肿瘤的发生、发展过程中有两方面的作用：一是在DNA复制时，胞嘧啶残基的5位碳原子会被S－腺苷酰甲硫氨酸上的甲基所取代，使得甲基胞嘧啶转化成为胸腺嘧啶，CpG二核苷酸转化成TpG二核苷酸，此时的DNA结构已被完全打破，严重影响了DNA分子、转录因子等蛋白的合成，进一步使基因的表达异常，从而影响正常的生理功能，最后发生突变直至丧失活性。其二，抑癌基因甲基化导致该基因沉默，CpG岛高甲基化可使抑癌基因转录失去活性，丧失对肿瘤的抑制能力，进而导致肿瘤的发生。

可将Caspase家族分成三类：第一类是以激发Caspase家族其他成员为主要作用的凋亡起始组，包括Caspase－2，Caspase－8，Caspase－9和Caspase－10；第二类是以可在激发下发生自身凋亡的效应组，包括Caspase－1，Caspase－4，Caspase－5，Caspase－12等；第三类是以参与炎性反应为主要作用的炎症组，包括Caspase－1，Caspase－4，Caspase－5，Caspase－12等[22]。作为第一类凋亡起始组的成员，Caspase－8可在源头起到遏制肿瘤的作用。本研究通过PCR试验方法可对Caspase－8基因甲基化进行高敏感度的检测。研究结果显示，Caspase－8蛋白基因的甲基化在非小细胞肺癌的阳性表达明显高于正常组织和癌旁组织（P＜0.05），从而推测，Caspase－8基因的高甲基化与非小细胞肺癌的发生、发展休戚相关，结合Caspase－8蛋白失表达的检测结果，可以大胆推断正是由于Caspase－8基因的高甲基化，才导致了Caspase－8蛋白的失表达，从而使非小细胞肺癌不断恶化。在不同癌症类型中，肺腺癌Caspase－8基因的甲基化程度最高，Caspase－8基因的甲基化程度与不同类型的肺癌亦有一定关系，这也证实了肺腺癌不良预后的临床转归，临床可根据Caspase－8基因的甲基化程度来判定非小细胞肺癌的预后。在不同分化程度的非小细胞肺癌中，Caspase－8基因的甲基化在低分化组中的表达最高（P＜0.05），说明Caspase－8基因甲基化在不同分化程度肺癌中有显著差异。在是否伴有淋巴转移的关于Caspase－8基因甲基化的分组检测中，可通过伴有淋巴转移组的甲基化高表达和结合Caspase－8蛋白低表达推断，是由于Caspase－8高甲基化导致了 Caspase－8蛋白在淋巴转移组的表达异常，故Caspase－8甲基化程度可作为诊断肺癌是否有淋巴转移的重要指标之一[23]。

综上所述，Caspase－8表达下调的主要原因在于Caspase－8基因CpG岛甲基化抑制了Caspase－8基因的表达，Caspase－8基因高甲基化可使该基因失去活性，无法形成Caspase－8蛋白，且Caspase－8基因甲基化的水平与Caspase－8蛋白的形成呈反比例关系，而Caspase－8蛋白的丢失使得肿瘤细胞的凋亡功能丧失，导致肿瘤细胞无休止地增生、分裂，进而大大提高了肿瘤的发生率。Caspase－8基因甲基化在临床中可被广泛应用于对早期肺癌判定的重要指标，也为非小细胞肺癌的转归和预后提供了良好的评判平台，为非小细胞肺癌的综合治疗指引了新的方向。

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App lication Value of FasL，Caspase－8 Protein Expression and Caspase－8 Gene M ethylation in Non－Sm all Cell Lung Cancer

Ye Yiwang，Wu Da，Liu Jixian，Wu Hao
（Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen，Guangdong，China 518036）

Objective To investigate the application value of FasL，Caspase－8 protein expression and Caspase－8 gene methylation in non－small cell lung cancer（NSCLC）.M ethods Totally 100 patients with NSCLC were selected，whose cancer tissues and paracancerous tissues（with tumor as the center of radius of 6 cm）were resected，among them；55 cases of pulmonary squamous cell carcinoma，30 cases of lung adenocarcinoma，and 15 cases of squamous cell carcinoma of the lung；50 cases were poorly differentiated carcinoma，30 cases were moderately differentiated carcinoma and 20 cases were highly differentiated carcinoma；there were 65 cases with lymph node metastasis，35 cases without lymph node metastasis，and 100 cases of normal lung tissue were taken as control.Immunohistochemical staining of S－P was used to detect the expression of FasL and Caspase－8 proteins in NSCLC specimens，methylation status of Caspase－8 gene in patients with NSCLC was detected by methylation specific polymerase chain reaction（PCR）.Resu lts FasL protein was mainly distributed in the serous layer of tumor cells，and a few were spread over the cell membrane.Caspase－8 protein distributed in the cell serous.In NSCLC，FasL protein and Caspase－8 protein in different degree of positive expression，the positive expression rate of FasL protein was significantly higher than those of adjacent tissues and normal tissues（P＜0.05），the positive expression in lung adenocarcinoma was significantly higher than those in squamous cell carcinoma and squamous cell carcinoma（P＜0.05），the positive expression rate in poorly differentiated carcinomas was obviously higher than those in moderately differentiated carcinoma and highly differentiated carcinoma（P＜0.05），the positive rate of FasL protein in lymph node metastasis was significantly lower than that in nonlymphatic metastasis（P＜0.05）.The positive expression rate of Caspase－8 protein was significantly lower than those of adjacent tissues and normal tissues（P＜0.05），the positive expression in lung adenocarcinoma was significantly lower than those in squamous cellcarcinoma and squamous cell carcinoma（P＜0.05），the positive expression rate in highly differentiated carcinomas was obviously higher than those in moderately differentiated carcinoma and poorly differentiated carcinoma（P＜0.05），the positive rate of Caspase－8 protein in lymph node metastasis was significantly lower than that in non－lymphatic metastasis（P＜0.05）.The rate of Caspase－8 gene methylation in cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues and normal tissues，the positive expression in lung adenocarcinoma was significantly higher than in squamous cell carcinoma and squamous cell carcinoma,the positive expression rate in poorly differentiated carcinomas is obviously higher than that of moderately differentiated carcinoma and highly differentiated carcinoma, the positive rate of Caspase－8 gene methylation in lymph node metastasis was significantly lower than that in non－lymphatic metastasis(P＜0.05).Conclusion High expression of FasL protein and Caspase－8 gene hypermethylation in NSCLC can accelerate the rate of lung cancer cells and tumor cells in the joint，inhibit the activity of immune cells，result in tumor formation without immune region and promote tumor cell division and growth，which become an important cause of early metastasis of adenocarcinoma.The expression of Caspase－8 protein in squamous cell carcinoma is higher，which is the main prognostic factor of squamous cell carcinoma.It is also one of the important indexes to judge the prognosis of NSCLC.Caspase－8 is involved in the evolution of NSCLC，and is closely related to the occurrence，development and metastasis of NSCLC.As an important prognostic factor of NSCLC，Caspase－8 provides an important theoretical basis for the comprehensive and targeted treatment of NSCLC.

FasL protein expression；Caspase－8 protein expression；Caspase－8 gene methylation；non－small cell lung cancer

R730.4；R734.2

：A

：1006－4931(2017)12－0001－07

2017－03－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.001

2014年深圳市卫生计生委系统科研项目[201401043]。

叶艺旺（1985－），博士研究生，主治医师，研究方向为肺癌的诊治，（电子信箱）yyw.ghl＠163.com。

△通讯作者：乌达，主任医师，研究方向为肺癌的诊治，（电子信箱）yywszyy＠163.com。