2—甲氧基雌二醇联用抗坏血酸诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡及细胞周期变化研究

张苏伟??曾嫦??林祥伟

[摘要] 目的 研究2-ME联合抗坏血酸在诱导CML细胞凋亡中的作用以及细胞周期的变化机制。 方法 收集2016年1～12月期间汕头市中心医院血液科已确诊的bcr/abl（+）慢性粒细胞白血病患者57例骨髓，应用流式细胞术分选出CML细胞并培养传代并随机分为四组。使用抗肿瘤化合物2-甲氧基雌二醇（2-ME）与抗坏血酸（AA）组合来处理慢性粒细胞白血病（CML）细胞，根据药物浓度分为：（1）未加药组；（2）2-ME组（2?mol/L）；（3）AA组（62.5?mol/L）；（4）2-ME联用AA组（2-ME：2?mol/L+AA：62.5?mol/L）四组。应用流式细胞术分析药物处理后的CML细胞凋亡情况和细胞周期的变化情况。结果用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用F检验。结果 2μmol/L 2-ME +62.5μmol/ LAA组可诱导CML细胞凋亡。 2-ME+AA以剂量依赖性方式诱导凋亡，在浓度2～8μmol/ L时凋亡呈时间-剂量依赖。2-ME+AA可诱导处于G0/G1期的细胞明显增多，处于S期的细胞减少。 结论 2-ME联合抗坏血酸可诱导白血病细胞以时间-剂量依赖式凋亡，且与细胞周期抑制有关。

[关键词] 白血病细胞；2-ME；抗坏血酸；流式细胞术；凋亡；周期变化

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）11-18-04

Study on apoptosis and cell cycle changes of CML cells induced by 2-Methoxy estradiol combined with ascorbic acid

ZHANG Suwei ZENG Chang LIN Xiangwei

Department of Laboratory， Shantou Central Hospital， Shantou 515031， China

[Abstract] Objective To study the role of 2-ME combined with ascorbic acid in the induction of CML cell apoptosis and the mechanism of cell cycle. Methods 57 Bone marrow of patients who diagnosed bcr/abl（+） chronic myeloid leukemia in Department of Hematology， Shantou Central Hospital between January 2016 and December 2016， was collected.And CML cells were sorted out by flow cytometry.CML cells were randomly divided into four groups.2-methoxy estradiol（2-ME） combined with ascorbic acid （AA） was used to treat chronic myeloid leukemia（CML） cells. According to the drug concentration is divided into four groups：（1）control；（2）2-MEgroup（2?mol/L）；（3）AA group （62.5?mol/L）；（4）2-ME combined with AA group（2-ME：2?mol/L+AA：62.5?mol/L）. Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and cell cycle of CML cells. Results CML cell apoptosis was induced by 2μmol/L 2-ME+62.5μmol/L AA group. 2-ME+AA induced apoptosis in a dose-dependent manner， and apoptosis was time-dose-dependent at the concentration（2-8μmol/L）. 2-ME+AA can induce cells in G0/G1 phase increased significantly， in the S phase of the cells decreased. Conclusion 2-ME combined with ascorbic acid can induce leukemia cells in time-dose-dependent apoptosis， and is related to cell cycle inhibition.

[Key words] Leukemia cells； 2-ME； Ascorbic acid； Flow cytometry； Apoptosis； Cycle change

慢性粒细胞白血病（CML）占血液恶性肿瘤的15%～20%，发生率为1～2/10万。大多数慢粒患者都有染色体易位，因有Ph染色体和bcr/abl融合基因存在，导致白血病细胞细胞对化疗药物产生抗药性[1]。因此寻找抗CML新药已成为研究热点。

在本研究中，我们收集2016年1～12月期间汕头市中心医院血液科已确诊的bcr/abl（+）慢性粒细胞白血病患者57例骨髓，应用流式细胞术分

选出CML细胞并培养传代并随机分为四组。使用抗肿瘤化合物2-ME与抗壞血酸AA组合来研究其对bcr/abl（+）CML细胞凋亡的影响，并探索白血病细胞周期的变化情况，为日后临床应用提供实验依据，期望针对CML组合治疗开辟了新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料和细胞培养

2-ME和AA均购自sigma公司，2-ME批号：705829，AA批号：1043003。收集已确诊的bcr/abl（+）慢性粒细胞白血病患者骨髓，应用流式细胞术分选出CML细胞，CML细胞在含有10%胎牛血清（FBS），100U/mL青霉素，100μg/ mL链霉素和2mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养，并在37℃，5%CO2饱和湿度下培养。每2～3天传代1次。

1.2 细胞分组及加药

所有CML细胞随机分为四组，且按处理药物浓度分为：（1）未加药组；（2）2-ME组（2?mol/L）；（3）AA组（62.5?mol/L）；（4）2-ME联用AA组（2-ME：2?mol/L+AA：62.5?mol/L）。

1.3 细胞凋亡检测

收集处理的各组细胞并以1500rpm离心5min。 弃去上清液，并将细胞用PBS重悬浮并计数。 取1×106重悬细胞，1500rpm离心5min，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温20～25℃暗处孵育10min。以1500rpm离心5min，弃去上清液，加入190μL Annexin V-FITC结合溶液以轻轻地重悬细胞。 加入10μL碘化丙啶染色溶液，轻轻混匀，冰浴置于适当位置，流式细胞术检测[12]。

1.4 细胞周期检测

CML细胞周期的测定应用流式细胞术来分析：在姬松茸多糖作用48h后的CML细胞以1×105个以体积分数为0.7的乙醇固定以后，用PBS洗2次，加入RNA酶30μL，在37℃下水浴30min，最后冰浴终止反应；用PBS洗1次，加入PI染液0.5mL，避光孵育30min后，上机检测，并分析细胞的周期变化。

1.5 统计学方法

使用SPSS11.5统计包来进行统计分析，结果用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用F检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2-ME+AA联用诱导CML细胞凋亡情况分析

CML细胞经2μmol/L的2-ME联含应用62.5?mol/L AA作用24后，流式细胞术检测凋亡率。2-ME联合AA可诱导CML细胞凋亡，两组间差异有统计学意义（P<0.05）。结果提示：2-ME和抗坏血酸单独使用并不引起白血病细胞凋亡，然而2-ME与AA联用可诱导白血病细胞凋亡。

2.2 2-ME+AA联合用药（不同剂量、不同时间）对细胞凋亡的影响情况分析

CML细胞分别用2、4、8μmol/L 2-ME +62.5μmol/L +AA处理24、36和48h。通过流式细胞术检测凋亡率。凋亡率结果显示2-ME联用抗坏血酸可以诱导白血病细胞产生凋亡，且浓度依赖式凋亡，差异有统计学意义（P<0.05）。结果提示，2-ME+AA在本实验处理浓度范围时间-剂量依赖性方式。见表2。

2.3 2-ME+AA联合用药对CML细胞周期的影响

结果显示，处于G0/G1期的细胞明显增多，处于S期的细胞减少，而G2/M期的细胞则无明显变化。说明药物作用CML后，可以把CML细胞周期阻滞与G0/G1期，减少细胞进入S期，从而起到抑制细胞的增殖的作用。

3 讨论

慢性粒细胞白血病（CML）占血液恶性肿瘤的15%～20%。大多数患有慢粒患者都有染色体易位，因有Ph染色体和bcr/abl融合基因存在，导致白血病细胞细胞对化疗药物产生抗药性[2]。凋亡是生物机体维持平衡的机制之一，此机制的作用就是帮助机体监测机体细胞的生老病死[3]。如果机体的凋亡机制紊乱，导致细胞逃脱体内的程序性死亡调控，进而导致大量增殖的肿瘤细胞的产生[4]。

2-甲氧基雌二醇（2-ME）是人体中雌二醇代谢的正常产物。近年来，2-ME抗肿瘤活性研究日益深入，大量的研究数据表明2-ME具有广泛的抗肿瘤活性[5]。2-ME抗肿瘤作用是通过增加肿瘤细胞内氧化损伤，抑制血管生成，抑制细胞增殖等，主要机制是引起的细胞内活性氧的水平升高[6]。2-ME通过内源性雌激素的羟基化和甲基化形成，2-ME单用或结合其他药物用于治疗乳腺癌，前列腺癌和多发性骨髓瘤，有研究发现2-ME具有抗白血病效果[7]。2-ME可通过死亡受体途径和线粒体途径诱导细胞凋亡[8]。最近的研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤增殖，实体瘤等非常重要的手段，血癌也不例外[9]。在血液系统肿瘤中，CML的特征在于凋亡受到抑制。其可能与BCR/ABL融合基因相关[10]。

抗坏血酸既具有氧化作用，又具有抗氧化作用，可以防止氧化损伤引起的ROS水平过高，而且产生过氧化氢又可以产生氧化损伤[11]。研究表明，过量的抗坏血酸对人体是有害的。然而，小剂量的抗坏血酸，通常<100μmol/L，可以作为抗氧化剂拮抗各种氧化损伤导致的细胞凋亡[12]。抗坏血酸作为一种抗氧化剂，最近表明，其在降低细胞内GSH浓度方面是有效的，特别是当存在增加体内活性氧活性的物质时[13]。抗坏血酸既具有氧化作用，又具有抗氧化作用，可以防止氧化损伤引起的ROS水平過高，而且产生过氧化氢产生氧化损伤，有研究表明，过量的抗坏血酸对人体有害[14]。然而，低剂量的抗坏血酸，通常<100μmol/L，可以拮抗由氧化剂的氧化损伤引起的多种细胞凋亡[15]。因此，我们使用抗坏血酸来降低细胞内GSH浓度，增加细胞中活性氧的浓度，并进一步增加肿瘤细胞对2-甲氧基雌二醇的敏感性并促进凋亡的作用。

流式细胞术检测凋亡的结果显示：2-ME联用AA可诱导CML细胞凋亡，且分别与未加药组、单独2-ME组、单独AA组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果提示：在正常的2-ME、AA剂量下（单独用药不会引起凋亡），2-ME联用AA可以诱导细胞凋亡。进一步的凋亡实验结果证明2-ME+AA联合用药（不同剂量、不同时间）对细胞凋亡的影响也是不同的。CML细胞经2、4、8μmol/L的2-ME+62.5?mol/L +AA分别作用24、36、48h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示：在一定的浓度范围内（2～8μmol/L）2-ME+62.5?mol/L AA诱导CML细胞凋亡的作用随着2-ME浓度的增加而增强，具有浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.01）。结果提示：一定浓度范围内（2～8μmol/L）2-ME+ AA诱导细胞凋亡作用呈时间-剂量依赖关系。

慢性粒細胞性白血病是一种遗传性疾病，其发生发展与细胞周期有关。细胞周期是细胞存活的基本过程，每个细胞经过细胞周期分化成熟衰老死亡这一循环[16]。在本研究中，用2-ME联合AA处理CML细胞，观察到G0/G1期的细胞显著增加，而在S期，G2/M期细胞无明显变化。这提示2-ME联用AA 处理CML细胞可以在G0/G1期阻断细胞周期进展，使得进入到S期的细胞减少，最终抑制细胞增殖。

作为一种新的白血病治疗方案，2-ME联合AA不仅可以促进CML细胞凋亡，且对正常细胞的副作用无明显，还可以通过细胞周期抑制白血病细胞CML的增殖。2-ME联合AA治疗白血病为白血病的治疗提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2017-04-05）