几种中药材对兔原代肾小管上皮细胞增殖作用影响的研究

赵 丹，张 雪，管 静，周 英，俸婷婷*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；4. 贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025；5.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550025)



几种中药材对兔原代肾小管上皮细胞增殖作用影响的研究

赵 丹1，2，3，4，张 雪5，管 静1，2，3，4，周 英1，2，3，4，俸婷婷1，2，3，4*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；4. 贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025；5.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550025)

通过体外培养兔原代肾小管上皮细胞，来研究大血藤、吴茱萸、豨莶草及川牛膝4种中药材提取物对肾小管上皮细胞增殖作用的影响。利用MTT法测定大血藤、吴茱萸、豨莶草及川牛膝4种中药材的水提与醇提的3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L三个浓度组对兔原代肾小管上皮细胞增殖作用的影响。结果表明，吴茱萸和豨莶草的醇提300 mg/L浓度组及大血藤的水提300 mg/L浓度组对兔原代肾小管上皮细胞的增殖作用抑制很强，其存活率分别仅有24.12%，16.03%和30.84%，而大血藤的醇提3 mg/L浓度组和豨莶草的醇提30 mg/L及3 mg/L浓度组对兔原代肾小管上皮细胞的增殖作用具有促进作用，其存活率达到了107.91%，114.95%和111.45%。大血藤、吴茱萸、豨莶草及川牛膝4种中药材对兔原代肾小管上皮细胞增殖作用均有不同程度的影响。

大血藤；吴茱萸；豨莶草；川牛膝；增殖作用

大血藤(Sargentodoxacuneata)，木通科大血藤属植物，具有抗炎，活血，祛风止痛等药理作用。吴茱萸(Tetradiumruticarpum)，芸香科吴茱萸属植物，具有止泻、散寒止痛等药理作用。豨签草(SiegesbeckiaorientalisL.)为菊科草本植物，具有祛风湿，利关节，抗炎等药理作用。川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)，苋科杯苋属植物，具有逐瘀通经，通利关节，降血压作用等药理作用[1]。这4种中药材均具有温补肾阳、利水渗湿、益气活血等功效，根据中医药理论中的性味归经之说，均可归属为肾经。根据归经理论，能够将药物的作用与人体的脏腑经脉之间的关系相结合，说明药物能治疗或作用的脏腑经脉的病变，从而就能具体的认识到药物的主要作用器官和药物的特殊功效[2]。本文旨在利用原代分离的兔肾小管上皮细胞对大血藤、吴茱萸、豨莶草及川牛膝4种中药材提取物对肾小管上皮细胞增殖作用的影响进行研究，为这4种中药材的应用及肾毒性作用的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

20天龄雄兔购自贵州省畜牧研究所实验基地，清洁级，合格证CSXK(黔)2012-001。

中药材：大血藤、吴茱萸(四平市百草堂中药饮片有限公司)；豨莶草(四川省川南药业有限公司)；川牛膝(成都市益诚药业有限公司)。

试剂：DMEM/F12(1∶1)(Hyclone)，胎牛血清(四季青)，胰蛋白酶(Amresco)，碱性磷酸酶染液—钙钴法(南京建成)，SP染液、CK18(北京博奥森)，DAB显色剂(北京中杉金桥)，噻唑蓝(MTT)，二甲亚砜(DMSO)。

仪器：旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器)，冷冻干燥机(北京松源华兴科技)，CO2培养箱、酶标仪(Thermo)，倒置荧光显微镜(宁波舜宇)，超净工作台(苏州净化)。

1.2 方法

1.2.1 中药材提取物的制备 分别称取大血藤、吴茱萸、豨莶草及川牛膝4种中药材100.0 g，粉碎，分别用双蒸水，75%乙醇为提取液，以料液比1∶10进行回流提取，80℃，1 h，连续提取3次。合并提取液，抽滤浓缩，再低温冻干，得到不同质量的提取物，低温密封保存，备用。

1.2.2 兔原代肾小管上皮细胞的分离与鉴定 以耳缘静脉注入空气处死，无菌切取双肾，浸泡于冷PBS中，剥离肾缔及肾包膜，保留肾皮质，剪碎，过80目筛，取筛上部分研碎，再过150目筛，取筛上部分，以1500 r/min，离心7 min，去上清液，再用胰酶消化15 min，终止消化，离心去上清液，再用完全培养基定容至10 mL，均分至两培养皿中，镜检。37℃，5%CO2培养，24 h后补加3 mL完全培养基，72 h后首次换液。

以浓度为1×105mol/mL的细胞接种于24孔板，爬片。37℃，5%CO2培养24 h。采用碱性磷酸酶染液(钙钴法)对肾小管上皮细胞进行滴染。免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)，DAB试剂显色。

1.2.3 中药材提取物对肾小管上皮细胞增殖作用影响的测定 称取中药材水提物0.1 g，溶于1 mL完全培养基中，梯度稀释至终浓度为3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L。称取中药材醇提物0.1 g，溶于1 mLDMSO中，用完全培养基梯度稀释至终浓度为3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L。

以浓度为1×105mol/mL接种于96孔板，每孔200 μL，37℃，5%CO2条件下培养24 h。弃上清液，更换新培养基，实验组更换含不同浓度中药材提取物的培养基，水提物空白对照组更换含完全培养基，醇提物空白对照组更换含2‰DMSO培养基，每组设置5个复孔。继续培养48 h，每孔加入20 μL MTT(终浓度0.5 g/L)，37℃，5%CO2条件下反应4 h，弃上清液，每孔加入150 μLDMSO，振荡10 min。490 nm处测OD值。以存活率为指标，反映中药材对肾小管上皮细胞的影响，计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 中药材制备的结果

共制备4种中药材的水煎物和醇提物，中药材提取结果见表1。

表1 中药材制备的结果

2.2 肾小管上皮细胞鉴定的结果

碱性磷酸酶化学染色呈阳性结果，细胞质中有灰黑色颗粒沉淀(图1)。

免疫组化染色呈阳性结果，围绕细胞核周围细胞质及胞浆中呈棕黄色沉淀，苏木素复染后颜色变深，呈棕褐色(图2)。碱性磷酸酶是肾小管上皮细胞中的标志性酶，细胞角蛋白CK18是肾小管上皮细胞特异性表达的角化蛋白。鉴定结果说明该细胞为所需的肾小管上皮细胞。

图1 兔肾小管上皮细胞碱性磷酸酶染色×400

2.3 中药材对肾小管上皮细胞增殖作用影响的结果

吴茱萸和豨莶草的醇提300 mg/L浓度组及大血藤的水提300 mg/L浓度组对兔原代肾小管上皮细胞的增殖作用抑制很强，其存活率分别仅有24.12%、16.03%和30.84%，而大血藤的醇提3 mg/L浓度组和豨莶草的醇提30 mg/L及3 mg/L浓度组对兔原代肾小管上皮细胞的增殖作用具有促进作用，其存活率达到了107.91%、114.95%和111.45%。川牛膝的水提和醇提的3 mg/L，30 mg/L和300 mg/L三个浓度组对肾小管上皮细胞增殖作用的影响很小，其存活率均不低于90%，除水提300 mg/L浓度组的存活率为88.40%。具体数值见表2。

图2 兔肾小管上皮细胞免疫组化结果

中药材水提物OD值水提物抑制率(%)醇提物OD值醇提物抑制率(%)空 白0．5241±0．04—0．5417±0．04—大血藤300mg/L0．1588±0．0130．840．2045±0．0239．72大血藤30mg/L0．5155±0．06100．140．3603±0．0469．98大血藤3mg/L0．5028±0．07102．340．5555±0．04107．91吴茱萸300mg/L0．3408±0．0460．650．1355±0．0124．12吴茱萸30mg/L0．3563±0．0663．410．3673±0．0265．37吴茱萸3mg/L0．3973±0．0370．710．4138±0．0273．65豨签草300mg/L0．4870±0．0994．600．0825±0．0016．03豨签草30mg/L0．4887±0．0394．920．5918±0．05114．95豨签草3mg/L0．4498±0．0287．360．5738±0．05111．45川牛膝300mg/L0．4753±0．0288．400．4910±0．0691．33川牛膝30mg/L0．5155±0．0395．890．5428±0．02100．96川牛膝3mg/L0．5138±0．0295．560．5395±0．02100．35

3 结论与讨论

人体内的代谢废物大部分通过泌尿系统排出体外，肾小管是肾脏的重要组成部分，亦是泌尿系统的重要功能性结构。代谢物在肾小球中进行超滤，形成原尿进入肾小管，在肾小管中进行重吸收最终形成终尿排出体外。在此过程中各种药物及其代谢物多数会直接与肾小管接触后再排出体外，因此肾小管上皮细胞成为了外源物毒性作用的靶向结构[3]。通过分离培养兔原代肾小管细胞，可以很快得到不同药材对该细胞增殖作用影响的结果。这种通过体外建模来研究药物的药理活性方法已经逐步普及，与体内试验相比，该方法具有靶向准确性高，出结果快，可信度高等优点，当然也存在评判标准不一等缺点，但是其数据也可作为药理实验的考察依据之一。

中药材大都来源于天然植物、动物及矿物质，且传统观念认为，相比于西药，其毒性和副作用相对较小，应用较为安全。随着国内中医药的快速发展，中药越来越受消费者的青睐，且中药的研究也备受关注，从而中药的使用范围也在不断扩大，其不良反应事件发生率也呈现增加的趋势。自20世纪60年代起，中药所致的肾损害病例被陆续报道，引起了世界各国药事管理部门和学界的广泛关注[4]。肾脏作为人体代谢排毒的重要器官之一，多种药物或其代谢产物大都必经此处，在肾小管过滤、重吸收，再排出体外。此过程必然会与肾小管上皮细胞直接接触，故采用体外培养肾小管上皮细胞，测验中药材对其的增殖毒性可从一方面反映中药材对肾的影响，且具有快速高效的优点。

大血藤、吴茱萸、豨签草及川牛膝在抗炎镇痛，祛风湿方面均具有一定药理作用[5-8]。并且在临床上，也有一定的应用，为了方便其在药理研究方面更好的利用，利用分离培养兔原代肾小管细胞来试验其对肾小管上皮细胞的增殖作用的影响是很有必要的。在本次实验中发现川牛膝的水提和醇提的不同浓度组对肾小管上皮细胞的增殖毒性都很低，并且醇提的中浓度组及低浓度组对该细胞还具有促进增殖作用，这样可以增大其用量使其达到最佳的药理疗效。而吴茱萸的水提及醇提的高中低三个浓度组对该细胞均具有增殖毒性，故而在做其他药理研究中，应尽量选择较低浓度，也可从吴茱萸较强的细胞毒性方面研究其一直细胞存活或生长途径。豨签草及大血藤的水提中浓度及低浓度组对该细胞的增殖毒性也很低，并且豨签草的醇提中低浓度组和大血藤的醇提低浓度组对该细胞还具有较好促进增殖作用，从而在做其他药理研究过程中适当的控制其用量。综上所述，试验中药材对兔原代肾小管上皮细胞增殖作用的影响可作为药材在药理研究过程中浓度筛选的依据之一。

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[2] 马 威，管竞环.中医内科疾病用药归经的分析与思考[J].中国中医基础医学杂志，2008(03)：209-210.

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Effects of Several Traditional Chinese Medicinal Materials on the Proliferation of Primary Renal Tubular Epithelial Cells in Rabbit

ZHAODan1，2，3，4，ZHANGXue5，GUANJing1，2，3，4，ZHOUYing1，2，3，4，FENGTing-ting1，2，3，4*

(1.SchoolofPharmaceuticalsciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025；2.GuizhouEngineeringCenterforTraditionalChineseMedicineandEthnicMedicine,Guiyang,Guizhou550025；3.ResearchandDevelopmentCenterforMedicineandEdiblePlantResourcesofGuizhou,Guiyang,Guizhou550025；4.MedicinalandEdiblePlantResourcesApplicationandDevelopmentEngineeringLaboratoryofGuizhou,Guiyang,Guizhou550025; 5.SchoolofPublicHealth,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550025)

The effects of extracts of four Chinese herbal medicines, namely Sargentodoxa cuneata、Tetradium ruticarpum、Siegesbeckia orientalisL and Cyathula officinalis Kuan, on the proliferation of renal tubular epithelial cells were studied by culturing rabbit primary renal tubular epithelial cells in vitro. The effects of 3 mg/L, 30 mg / L and 300 mg / L of water extraction and alcohol extraction of the four herbal medicines on tubule epithelial cell proliferation were studied by MTT method. The results showed that 300 mg / L of the alcohol extract of T. ruticarpum and S. orientalis and the water extract of 300 mg / L of S. cuneata significantly inhibited the proliferation of primary renal tubular epithelial cells by 24.04%, 16.03% and 30.84%, respectively. 3 mg / L of the alcohol extract of S. cuneata and 30 mg / L and 3 mg / L of alcohol extract of S. orientalis showed a proliferation effect on primary renal tubular epithelial cells, and the survival rate reached 107.91%, 114.95% and 111.45%. All of the four Chinese herbal medicines had some effects on the proliferation of primary renal tubular epithelial cells in rabbit.

sargentodoxacuneata；tetradiumruticarpum；siegesbeckiaorientalisL；cyathulaofficinaliskuan； proliferation effect

2017-02-25；

2017-04-16

贵州省药食同源资源研究开发科技创新人才团队(黔科合人才团队(2015)4010号)；贵州省中药民族药制药工程专业学位研究生工作站(黔教研合JYSZ字[2014]002)；贵州省科技重大专项子课题(黔科合J重大字[2015]2002-3-4)；贵州省高层次创新型人才培养(黔科合人才(2015)4032号)。

R914

A

1008-0457(2017)04-0076-04 国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.014

*通讯作者：：俸婷婷(1983-)，女，副教授，主要研究方向：中药民族药药理毒理研究；E-mail： ftt0809@163.com。