铁皮石斛破壁饮片中多糖含量测定

路 希，李 俐，王慧娟，林 冰，周 英*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025)



铁皮石斛破壁饮片中多糖含量测定

路 希1，2，3，李 俐1，王慧娟2，3，林 冰2，3，周 英2，3*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025)

建立铁皮石斛破壁饮片中多糖含量的测定方法，并对其进行方法学验证。用水提醇沉法提取铁皮石斛破壁饮片中的多糖，采用苯酚—硫酸法对12批次铁皮石斛中的多糖进行含量测定。结果表明：该测定方法经精密度、稳定性、重复性考察后 RSD < 3%，加样回收率为100.94%，试验稳定可靠，可用于铁皮石斛破壁饮片中多糖含量的测定。

铁皮石斛；破壁饮片；多糖；含量测定

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)为兰科(Orchidaceac)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物。在我国主要分布于云南、广西、海南、贵州、台湾等地。具有益胃生津，滋阴清热的作用，用于热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软[1]。

破壁饮片是采用现代超微技术，将中药饮片粉碎至300目、粒径小于45 μm，可供直接口服使用的新型中药饮片。中药破壁饮片具有高效免煎、携带方便、质量可控、安全卫生等特点，因此成为近年中药研究的热点。多糖在铁皮石斛中的含量较高，是其主要活性成分，具有良好的抗肿瘤、抗氧化和增强免疫力[2-7]等作用。为了有效控制铁皮石斛破壁饮片的质量，本试验结合中国药典对铁皮石斛中多糖的含量测定方法进行研究，旨在为铁皮石斛破壁饮片的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 12批铁皮石斛微粉(由贵州涵龙生物科技有限公司提供)。

1.1.2 仪器与试剂Evolution201紫外-可见分光光度计(ThermoScientific)；FA1104电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；Neofuge23R台式高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)。

无水葡萄糖(中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，批号：110833-201506，含量99.9%)；葡聚糖(上海甑准生物科技有限公司，产品批号为9004-54-0)；无水乙醇(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)；浓硫酸(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)；苯酚(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；水为纯净水。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备 参照2010版《中华人民共和国药典》第一部铁皮石斛中多糖含量测定项下方法，制备供试品溶液[1]。

1.2.2 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖对照品23.6 mg，精密称定，置于250 mL的容量瓶中，用水溶解并定容，摇匀，作为标准溶液。

1.2.3 检测波长的确定 取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，分别精密加入5%苯酚溶液1 mL(临用配制)，摇匀，再精密加硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以相应试剂为空白，在400～600 nm范围内进行扫描，记录紫外-可见吸收光谱图。从图1、图2可知，对照品和供试品显色后在488 nm波长处有最大吸收，因此选择488 nm为测定波长。

图1 葡萄糖对照品溶液紫外吸收光谱

图2 铁皮石斛供试品溶液紫外吸收光谱

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 线性关系考察 对照品溶液的制备，取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含94.4 μg的溶液，即得；标准曲线的制备，参照2010版《中华人民共和国药典》第一部铁皮石斛中多糖含量测定项下方法，制备葡萄糖标准曲线[1]。1.2.4.2 精密度试验 精密量取对照品溶液0.6 mL，置10 mL具塞试管中，加水补至1.0 mL；按“1.2.4.1”项下标准曲线制备的方法，从“精密加入5%苯酚溶液1 mL”开始测定吸光度，计算RSD值。

1.2.4.3 重复性试验 取本品(样品编号为10批)，按1.2项供试液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，按“1.2.4.1”项下标准曲线制备的方法，从“取供试品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”开始测定吸光度，计算RSD值。

1.2.3.4 稳定性试验 取“1.2.4.3”项下重复性试验中的第一份供试液，按“1.2.4.1”项下标准曲线制备的方法，从“取供试品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”开始测定吸光度，在488 nm波长处每隔10 min测一次吸光度，并计算RSD值。

1.2.4.5 加样回收率试验 取葡聚糖约0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1.0 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度。量取葡聚糖供试品溶液1.0 mL，置10 mL具塞试管中，显色后在488 nm的波长处测定吸光度，计算葡聚糖中多糖的含量。平行称取6份第10批铁皮石斛微粉，每份约0.15 g，分别加入葡聚糖约50 mg(多糖含量为874.16 mg/g)，按照1.2.1项下供试品溶液制备的方法，制备葡聚糖供试液，取供试液2 mL，按上述线性关系中的供试品溶液的制备方法得到溶液，按“1.2.4.1”项下标准曲线制备的方法，从“取供试品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”开始测定吸光度，计算平均回收率以及RSD值。

计算公式：

2 结果与分析

2.1 线性关系与方法学考察结果2.1.1 线性关系 以葡萄糖对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图3)。得到回归方程y=0.073 1x+0.003 8(R2=0.998)，葡萄糖在2.70～13.49 μg/mL范围内呈良好线性关系。

图3 葡萄糖对照品标准曲线图

2.1.2 精密度试验 精密量取对照品溶液0.6 mL，置10 mL具塞试管中，加水补至1.0 mL。按“1.2.4.1”项下标准曲线制备的方法，在488 nm波长处连续测定6次，结果见表1。吸光度RSD为0.73%。表明仪器精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.1.3 重复性试验 取本品(样品编号为10批)，按“1.2.1”项下供试品溶液的制备，平行制备6份供试品溶液，分别进行测定，计算得到RSD为0.91%(如表2)，表现该方法重现性良好。

2.1.4 稳定性试验 取“1.2.4.3”项下重复性试验中的第一份供试液，按“1.2.1”项下供试品溶液的制备，从“取供试品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”开始测定吸光度，在488 nm波长处每隔10 min测一次吸光度，计算得到RSD为1.36%。说明该测定方法于200 min内稳定。

表2 重复性试验结果

表3 稳定性试验结果

2.1.5 加样回收率试验 “1.2.4.5”项下测定的葡聚糖中多糖含量见表4。

表4 葡聚糖的含量测定

表5 多糖测定的加样回收率试验

平行称取6份第10批铁皮石斛微粉，每份约0.15 g，分别加入葡聚糖约50 mg(多糖含量为874.16 mg/g)，按照1.2.1项下供试品溶液制备的方法，制备葡聚糖供试液，取供试液2 mL，按上述线性关系中的供试品溶液的制备方法得到溶液，按“1.2.4.1”项下标准曲线制备的方法，从“取供试品溶液1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL”开始测定吸光度，计算RSD为0.97%，平均回收率为100.94%(如表5)。表明该方法准确性良好。

表6 12批样品中多糖测定结果

2.2 铁皮石斛破壁饮片中多糖含量测定

取12批铁皮石斛饮片(破壁)样品，分别按“1.2.1”项下的方法制备供试品溶液，显色后进行测定，计算含量，结果见表6。

由表6可知，12批次的铁皮石斛破壁饮片的多糖含量介于26.25%～31.60%之间，发现多糖含量均大于药典中关于铁皮石斛原药材规定的(25%)，但是12批次之间有较大的差异，这可能与种植的环境以及采收的年限有关。每一批次的重复性实验中RSD<3%，表明该实验方法稳定可行。

3 结论与讨论

本研究采用水提醇沉法提取铁皮石斛破壁饮片中多糖，采用苯酚—硫酸法对12批次铁皮石斛中的多糖进行含量测定，结果表明该试验稳定可靠。在多糖测定的加样回收率实验中，多以单糖(葡萄糖)做为对照品，且葡萄糖的加入是在水提醇沉之后。由于葡萄糖没有参与前期的水提醇沉过程，常导致实验结果偏高(加样回收率达为106.55%)[8-10]。葡聚糖是以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，本实验以葡聚糖为对照品进行加样回收率实验，且将葡聚糖加入的时间设置在水提醇沉之前。结果显示，与用葡萄糖为对照品的方法相比较，减少了实验误差(加样回收率达为100.94%)，表明该方法可用于铁皮石斛破壁饮片中多糖的含量测定，但这方法是否适用于其它多糖含量的测定尚需更多的实验验证。

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Study on the Content Determination Method of Dendrobium Officinale Wall-broken Decoction Pieces Polysaccharide

LUXi1，2，3，LILi1，WANGHui-juan2，3，LINBing2，3，ZHOUYing2，3*

(1.CollegeofPharmacy，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025China；2.GuizhouTraditionalChineseMedicineandEthnicdrugEngineeringCenter，Guiyang，Guizhou550025China；3.GuizhouMedicineEdiblePlantResourcesResearchandDevelopmentCenter，Guiyang，Guizhou550025China)

A method for determination of polysaccharides in wall-broken decoction pieces ofDendrobiumofficinalewas established and it was proved by methodological validation. Polysaccharide in 12 batches ofD.officinalewas extracted by water-extraction and alcohol-precipitation method，and then determined by phenol-sulfuric acid method.The results showed that the RSD<3% and the recovery rate were 100.94% after investigation of precision，stability and repeatability.The assay was stable and reliable，and could be used for the determination of polysaccharides in wall-broken decoction pieces ofD.officinale.

dendrobiumofficinale；cell wall-broken decoction pieces；polysaccharide；content determination

2016-11-17；

2017-03-20

贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心(黔科合G字[2015]4001号)；贵州省药食两用资源应用开发工程实验室(黔发改投资[2015]542号)；施秉中药材产业科技合作专项计划项目合同书(施中药科合专项(2013)号)。

R927.2

A

1008-0457(2017)03-0091-04 国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.03.017

*通讯作者：周英(1971-)，女，博士，教授，主要研究方向：药物化学、天然产物化学的研究；E-mail：yingzhou71@126.com。