糖基化反应改善植物蛋白乳浊液稳定性的研究进展

吴周山,陆利霞,2,熊晓辉,2,薛 峰,李 晨,*(.南京工业大学食品与轻工学院,江苏南京 2800; 2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心,江苏南京 20009; .南京中医药大学药学院,江苏南京 2002)



糖基化反应改善植物蛋白乳浊液稳定性的研究进展

吴周山1,陆利霞1,2,熊晓辉1,2,薛 峰3,李 晨1,*
(1.南京工业大学食品与轻工学院,江苏南京 211800; 2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心,江苏南京 210009; 3.南京中医药大学药学院,江苏南京 210023)

植物蛋白乳浊液是一种不稳定体系,糖基化反应能够有效地改善蛋白质乳浊液的稳定性。本文主要介绍了蛋白质糖基化的反应机理,综述了糖基化反应对大豆蛋白、花生蛋白、燕麦蛋白等各类植物蛋白乳浊液稳定性影响的国内外研究进展,并总结了乳浊液体系稳定性的研究方法。

植物蛋白质,糖基化反应,乳浊液稳定性

植物蛋白是一类来自于植物的蛋白质,富含各种氨基酸。由于其具有丰富的营养和许多优良的功能特性,被广泛地应用于多种食品中,如肉类食品、焙烤食品、乳制品、饮料等[1]。相对于动物蛋白来说,植物蛋白一般不含或仅含有少量的对人体健康有影响的物质,如胆固醇、油脂、浓缩的荷尔蒙和抗生素等物质。因此,每天摄入一定量的植物蛋白食品代替动物蛋白更符合人类的健康饮食需求,其中植物蛋白饮料由于其营养丰富,口味独特,且富含各种蛋白质和氨基酸等特点,成为各大卖场的热销植物蛋白食品。然而,植物蛋白饮料在生产过程中所形成的植物蛋白乳浊液容易发生油水分离,导致在贮藏过程中会出现蛋白质沉淀和脂肪上浮等现象[2]。为了得到稳定的蛋白乳浊液体系,国内外众多学者对此进行了深入研究。

通过物理、化学或酶处理等改性方法可以提高蛋白质乳浊液的稳定性[3]。然而,这些方法都存在一些明显的弊端。物理改性需要依靠外部的机械力,对蛋白的改性方向具有随机性;大多数的化学修饰存在对人体潜在的健康危害以及破坏产品的外观从而使其在食品工业中的应用无法推广;酶处理具有不稳定性以及费用相对较高。近些年来,还有一种我们研究比较多的方法,通过糖基化反应改善蛋白乳浊液的稳定性。糖基化反应是蛋白质热处理过程中最常见的一种反应,经常发生于蛋白质的储存过程中,也被称之为非酶褐变反应[4]。糖基化反应的过程主要是通过共价键将蛋白质分子游离的氨基酸或者ε-氨基团与还原糖连接形成糖—蛋白聚合体。与其它改性方法相比,糖基化反应是一种自然发生的反应,无需提供特殊的装置,具有安全性高、应用前景好等特点,已经被广泛用来改善蛋白质乳浊液的稳定性[5]。许多学者对大豆蛋白、花生蛋白、燕麦蛋白等植物蛋白质与多糖类化合物经过糖基化反应合成新的蛋白-多糖聚合体进行了研究,结果表明,新合成的糖蛋白的乳化性以及蛋白乳浊液的稳定性都有不同程度的改善。

1 糖基化改性蛋白改善乳状液稳定性的机理

乳浊液属于热力学不稳定体系。在贮藏过程中,乳浊液会出现不稳定现象。引起乳浊液失稳的机制主要包括相转化、絮凝、聚结、分层、沉降和奥氏熟化。由于乳浊液的热力学不稳定性,液滴会发生凝聚,从而发生去稳定现象。早期Dickinson和Galazka[6]曾经对糖基化反应改善乳浊液体系的稳定性做出了一些假设:糖基化形成的大分子产物蛋白-多糖聚合体能够提高乳浊液体系的稳定性主要是由于共聚物结合了蛋白质和糖的一些性质,一方面蛋白质的疏水性能够使得共聚物紧密的吸附在油-水界面,另一方面多糖的亲水性使得共聚物能够很好地溶解于乳浊液体系中,从而使得共聚物乳浊液体系变得稳定。随着不断探索,Dickinson[7]又提出了一些新的观点:蛋白-多糖聚合体能够进一步使得蛋白质乳浊液体系变得稳定，主要是因为蛋白质和多糖形成共聚物后能够控制乳浊液的流变学特性,并且共聚物分子间能够在连续相中形成网状空间结构,从而能够延迟相分离以及由重力引起的乳状液分层。

当然,也有一些其他的学者对糖基化反应改善乳浊液体系稳定性的机理做出了一些解释。Liu等[8]认为为了使蛋白质乳浊液体系变得稳定,可以通过糖基化反应形成蛋白-多糖聚合体以降低其乳浊液体系的界面张力,形成稳定的界面膜。Yaday和Chen[9-10]具有相似的观点:乳浊液体系中,当多糖分子吸附在蛋白质上形成蛋白-多糖聚合体后能够在乳浊液中的液滴表面形成一个厚的保护膜,从而抑制了乳浊液体系中的液滴之间发生沉淀、絮凝和聚集等现象,使得乳浊液体系变得稳定。

通常当蛋白质处于pH为等电点的环境下会发生聚集沉淀现象。而Wong等[11]通过将可溶性小麦分离蛋白(sIWP)、可溶性小麦分离蛋白和分子质量为9～11 kDa的葡萄聚糖反应形成的蛋白-多糖聚合体(sIWP-D10)、可溶性小麦分离蛋白和分子质量为64～76 kDa的葡萄聚糖反应形成的蛋白-多糖聚合体(sIWP-D65)在pH4和pH7的环境下的稳定性进行了测试。结果显示在pH7时三者都能保持稳定,pH4时,IWP发生聚集沉淀现象,IWP-D10相对较稳定没有发现明显沉淀和聚集现象,而IWP-D65能够保持稳定(见图1)。在pH4时,由于IWP的离子缺失以及空间结构的破坏使得蛋白质分子出现了絮凝现象;对于IWP-D10,由于N末端蛋白质扩散层的破坏使得共轭的D10葡萄聚糖分子的暴露,而D10葡萄聚糖能够提供一个物理屏障抑制了乳浊液的絮凝;对于IWP-D65,在pH7时D65葡萄聚糖共轭物的N末端能够额外形成一个大约5.9 nm厚的碳水化合物空间层位于乳浊液界面使得体系变得稳定,在pH4时,D65葡萄聚糖可以提供一个更加稳定的空间屏障来保护乳浊液的稳定性。

图1 sIWP,sIWP-D10聚合体,sIWP-D65聚合体在pH4和pH7环境下的稳定机理[12]Fig.1 The stability mechanism of sIWP,sIWP-D10 polymers, sIWP-D65 polymers in the environment of pH4 and pH7[12]

2 各类植物蛋白糖基化改性后对乳状液稳定性的影响

2.1 大豆蛋白

大豆蛋白与牛奶蛋白有相近的氨基酸组成。在营养价值上,可与动物蛋白等同,在基因结构上也最接近人体氨基酸,因此被视之为最具营养的植物蛋白。大豆蛋白本身就具有一定的乳化性,如在罗非鱼蛋白中添加大豆蛋白形成的罗非鱼-大豆蛋白共沉淀物,较之单纯的罗非鱼蛋白的乳化性,共沉淀物的乳化性有了明显的提高[13];在冰淇淋中添加部分大豆分离蛋白,其组织形态完整,无粗糙感[14]。但由于单纯的大豆蛋白结构具有不稳定性,其功能特性在实际应用中随着加工条件的改变而发生变化,使得大豆蛋白的应用范围得到了一定的限制。通过糖基化反应能够改善大豆蛋白的乳浊液性质,能够使大豆蛋白的应用界限得以一定程度的拓宽。表1列举了不同研究人员对大豆蛋白的糖基化改性的实验内容及实验结果。

表1 不同研究人员对大豆蛋白的糖基化改性的实验内容及结果Table 1 The experiment content and results of different researchers on the glycosylation of soybean protein

表2 不同研究人员对花生蛋白的糖基化改性的实验内容及结果Table 2 The experiment content and results of different researchers on the glycosylation of peanut protein

2.2 花生蛋白

花生中含有25%～36%的蛋白质,其中大约有10%的蛋白质是水溶性蛋白,又称为乳清蛋白,其余90%为盐溶性蛋白。花生蛋白与大豆蛋白相比,具有易消化、无豆腥味等优点,同样也是一种营养价值较高的植物蛋白,含有人体所需的八种必须氨基酸。花生蛋白乳浊液的不稳定性限制了其在食品工业中的应用。

经研究,发现多糖蛋白之间的相互作用可以影响蛋白的功能特性,其中乳化性也会随之改变。在食品工业中,人们常常利用这种特性来提高花生蛋白乳浊液的稳定性。表2列举了不同研究人员对花生蛋白的糖基化改性的实验内容及实验。

2.3 燕麦蛋白

燕麦是一种特色的杂粮作物,富含蛋白质、脂肪、膳食纤维等营养素。1997年美国FDA认定燕麦为功能性食物,具有降低胆固醇、平稳血糖的功效。美国《时代》杂志评选的“全球十大健康食物”中燕麦位列第五,是唯一上榜的谷类。燕麦中含有大约16%的蛋白质,其中球蛋白占50%左右。球蛋白是一种在三级结构上与大豆球蛋白相似的蛋白质[22]。因此,燕麦蛋白受到了人们的广泛关注。为了提高其应用前景,有研究者利用糖基化反应对其进行了改性研究。

Zhang B等[23]利用木糖、葡萄糖、乳糖、20 ku葡聚糖和40 ku葡聚糖与燕麦蛋白在90 ℃、pH9的反应条件下进行糖基化反应,然后对反应产物的功能性质进行研究,结果表明:葡萄糖与燕麦分离蛋白的糖基化产物溶解度大幅提高,多糖特别是40 ku葡聚糖与燕麦分离蛋白生成的糖基化产物具有较高的乳化活性和乳化稳定性。陈世超等[24]以燕麦蛋白作为研究对象,通过改变反应条件,对燕麦蛋白-葡萄聚糖进行湿热复合改性,发现反应物以质量比为1∶1,在100 ℃、pH9的反应环境下反应120 min,改性后的蛋白以多糖聚合体的功能性质最佳,溶解性提高到了82%,乳化性和乳化稳定性得到了显著提高。

2.4 其它植物蛋白

Horax R等[25]对成熟的苦瓜种子中的蛋白质(BMSPI)进行了糖基化改性研究,结果表明:糖基化产物具有良好的乳化特性,并能够很大程度地提BMSPI乳浊液稳定性。

DU Y等[26]以K-卡拉胶作为糖基供体,将大米渣滓谷蛋白与K-卡拉胶以1∶2的质量比进行美拉德反应,对反应产物功能性质进行研究,结果表明:K-卡拉胶-大米渣滓谷蛋白聚合体乳浊液的稳定性得到了一定程度的提高,能够适应低pH和高离子强度的环境。

3 乳浊液体系稳定性的研究方法

目前,对于乳浊液体系的稳定性的研究主要是通过测定乳浊液体系的浊度、粒径大小、粒径分布以及动态流变等参数来确定的。常见的方法主要有透射光浊度法、粒度分析仪法、乳浊液比例分析法等。

3.1 透射光浊度法

透射光浊度法是利用浊度计对乳浊液的浊度进行测量,通过观察光透过乳浊液时的透过率的变化来确定乳浊液内部颗粒大小的变化[27]。Jing H等[28]对蛋清蛋白和果糖进行糖基化反应,利用浊度法来判断蛋清蛋白糖基化反应前后的乳浊液体系稳定性,结果表明:糖基化产物的乳浊液体系在相同时间内较反应前的蛋白乳浊液体系的浊度变化并不明显,可以看出糖基化反应后的产物乳浊液体系在一定时间内更趋于稳定。Chen H Y等[29]在研究糖基化反应改善卵黄高磷蛋白乳浊液稳定性的实验中也用到了浊度法,利用分光光度计在500 nm处对乳浊液体系测量获得数据来表示乳浊液体系的稳定性,数据显示卵黄高磷蛋白和葡萄聚糖的糖基化产物的乳浊液体系不仅较单纯的卵黄高磷蛋白的乳浊液体系稳定,并且能够在酸性环境下具有较高的稳定性。

除了可以直接测量乳浊液体系的浊度,也可以测量乳浊液体系的浊度半衰期。Hashemi等[30]在研究溶菌酶素和黄原胶的糖基化产物的功能性质时,利用浊度法对溶菌酶素-黄原胶共价聚合物的乳浊液稳定性改善情况进行描述,发现溶菌霉素-黄原胶共价聚合物乳浊液的浊度半衰期较单纯的溶菌酶素的乳浊液的浊度半衰期有明显的延长,可以看出糖基化反应对于溶菌霉素的乳浊液稳定性有一定的改善。

3.2 粒度分析仪法

粒度分析仪法是通过粒度分析仪来测定乳浊液体系中的分子粒度,以及乳浊液颗粒平均粒径的变化来确定乳状液的稳定性[31]。

Dunlap[32]在研究多糖的大小对乳浊液稳定性影响的实验中,通过粒度分析法对β-乳球蛋白-多糖共价聚合物的乳浊液体系以及β-乳球蛋白乳浊液体系的粒度平均直径大小来判断乳浊液体系稳定性差别,结果发现:单纯的β-乳球蛋白乳浊液体系的粒度平均直径在90 d之内随着时间的变化发生了明显的变化,而β-乳球蛋白和一定大小分子质量的多糖共价聚合物的乳浊液体系的粒度平均直径随着时间的变化并未发生明显的变化。Bi B W等[33]对β-乳球蛋白和塞雅阿拉伯树胶(ASY)糖基化反应的共聚物的乳浊液性质进行了研究,实验过程中将纯的塞雅阿拉伯树胶和糖基化不同反应时间下形成的共价聚合物的乳浊液在经过加速度操作后对乳浊液的稳定性进行了测试并利用粒度分析仪测量乳浊液的粒度平均直径,结果发现:在7 d储存过程中,单纯的ASY的粒度直径从10 μm变成了57 μm,糖基化反应时间在12 h之内的糖基化共价聚合物的乳浊液体系的粒度直径有小幅度的变化,而反应时间超过12 h的糖基化共价聚合物的乳浊液体系的粒度能够保持稳定,没有发生明显变化。

3.3 乳浊液比例分析法

乳浊液比例分析法较之透射光浊度法和粒度分析仪法,具有准确、简便、仪器依赖性不强等特点。因此在对乳浊液稳定性评估过程中也经常被采用。

Zhang J B等[34]以麦芽糖糊精作为糖基和大豆分离蛋白发生糖基化反应,对产生的共价聚合物的乳浊液性质进行了测定,通过将10 mL乳浊液样品放置于高140 mm内直径15 mm的玻璃管中储存2个月,随后对样品乳浊液稳定性进行测量,将CI(%)=(Hsl/HT)×100(Hsl:乳浊液乳清高度;HT:乳浊液总高度)作为评判乳浊液稳定性的标准,当CI越小,说明乳浊液体系越稳定。在实验过程中为了节省时间,时浩等[35]在乳浊液稳定性判定过程中,通过先将乳浊液进行离心,乳浊液若分层,将上层高度记为h,下层高度记为H,利用h/H的大小来判断乳浊液的稳定性,认为当h/H小于0.07时,乳浊液是稳定的。

3.4 其它研究方法

透射光浊度法、粒度分析法和乳浊液比例分析法是目前人们对乳浊液体系稳定性判定常用的方法。当两种乳浊液进行对比时,也可以通过直接观察法来判定乳浊液的稳定性。

César等[36]研究植物蛋白和多糖对乳浊液的影响,发现大豆可溶性多糖和大豆分离蛋白的混合乳浊液在中性pH和pH为3～4的环境下储存15 d后保持稳定,而果胶和大豆分离蛋白的混合乳浊液在同样的环境下发生了絮凝和液滴聚集等不稳定现象。

4 蛋白-多糖共价复合物乳浊液的潜在应用

蛋白-多糖共价复合物乳浊液具有较好的乳化性以及稳定性。蛋白多糖共价复合物能够使油珠变得稳定避免其由于外界环境影响,如pH、盐、冷冻、脱水和机械搅拌,发生聚集现象。另外,具有生物活性的亲油性化合物也能通过在其内部油相中加入蛋白-多糖乳浊液使其和其它水溶性成份分隔开从而将其保护起来免受外界环境影响,避免发生化学降解。基于这些性质,蛋白-多糖共价复合物乳浊液在食品产业、医药和化妆品领域有很多潜在的应用价值[37]。

在食品产业中蛋白-多糖共价复合物乳浊液一方面能够提高乳化性,另一方面也可为其提供保护机制。对于一些富含多元不饱和脂肪酸的油类,由于其具有低溶解性以及容易发生氧化等特点,使它们的应用受到了很大的限制。我们可以通过豌豆分离蛋白和果胶反应制成乳化剂,然后通过喷雾干燥进行微囊化加入到这些食品中将这些问题得到解决[38]。能够通过控制蛋白-多糖乳浊液中油滴的表面电荷和厚度来将油滴内部环境和外面分隔开,以此来将油滴内部物质和外面环境之间的相互作用降到最小,从而使得和蛋白-多糖乳浊液混合的物质变得更加稳定。如,在ω-3脂肪酸中加入蛋白-多糖乳浊液可以提高其抗氧化性[39]。一些亲脂性脂肪酸化合物,如,类胡萝卜素、维生素类和一些风味调料,也可以通过这种方法来提高化学稳定性[40-41]。

在医药中,我们可以看到各种药品在临床上使用,然而有一部分具有很好医疗效果的物质由于在水中具有低溶解性而未能在临床上见到。我们可以通过在这些物质中加入蛋白-多糖共价复合物乳浊液来改善其溶解性,并使其变得更加稳定。另外,也可以结合微胶囊技术,将蛋白-多糖公共价复合物乳浊液作为壁材来对药物进行包埋。通过变化微胶囊壁的厚度来控制药物释放的速度并对药物进行保护,免受外界环境影响[42]。但是,这一技术并未成熟,微胶囊壁材的选取,以及微胶囊壁厚度的控制等问题都需要我们去解决。

在化妆品领域,随着人们生活水平的提高,人们对于皮肤的保养看得越来越重。化妆品中的护肤品大都是乳液形式。但大部分护肤品都存在保存时间较短、不易被皮肤吸收达不到很好的护肤效果等问题。根据蛋白-多糖共价复合物乳浊液的高乳化性以及稳定性,或许我们能够在护肤品中添加蛋白-多糖乳浊液来解决这种问题。另外,植物蛋白和多糖都可做为天然产物,它们的共价复合物蛋白-多糖乳浊液可以作为一种绿色物质做为护肤品的选材。

5 结语

糖基化反应能够在一定程度上有效地改善植物蛋白质乳浊液的稳定性,为植物蛋白质乳浊液在食品、医药、化工等领域 的有效应用提供了广泛的可能性。但关于糖基化过程中存在的一些问题,如糖基供体的选择、糖基化反应条件的优化以及糖基化改性机理等仍需要我们进一步去研究和探讨。

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Research progress of glycosylation reaction to improve plant protein emulsion stability

WU Zhou-shan1,LU Li-xia1,2,XIONG Xiao-hui1,2,XUE Feng3,LI Chen1,*

(1.College of Food and Light Industry,Nanjing University of Technology,Nanjing 211800,China; 2.Jiangsu Public Technical Service Center for Rapid Detection of Food Safety,Nanjing 210009,China; 3.College of Pharmacy,Nanjin University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China.)

Vegetable protein emulsion was an unstable system,and the emulsifying properties could be effectively improved by the protein glycosylation reaction. In this paper,the mechanism of glycosylation reaction was introduced,and the effects of glycosylation were reviewed domestic and overseas on functional properties of protein emulsion such as soy protein,peanut protein,oat protein and other kinds of vegetable protein,and meanwhile the methods for emulsion system stability were summarized.

vegetable protein;glycosylation reaction;stability of emulsion

2017-02-13

吴周山(1993-)，男，硕士，研究方向：食品化学，E-mail：wuzhoushan@njtech.edu.cn。

*通讯作者:李晨(1987-)，女，博士，讲师，研究方向：食品化学，E-mail：lichenfs@njtech.edu.cn。

江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20150950)；国家自然科学基金青年科学基金项目(31501529)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)14-0336-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.066