超声波辅助碱处理增溶米渣蛋白工艺优化

潘 征,MIAO Song,3,沈凯青,蔡小华,张龙涛,3,*,郑宝东(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002; 2.中爱国际合作食品物质学与结构设计研究中心,福建福州 350002; 3.替格斯食品研究中心，爱尔兰科克市 999014)



超声波辅助碱处理增溶米渣蛋白工艺优化

潘 征1,2,MIAO Song1,2,3,沈凯青1,2,蔡小华1,2,张龙涛1,2,3,*,郑宝东1,2
(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002; 2.中爱国际合作食品物质学与结构设计研究中心,福建福州 350002; 3.替格斯食品研究中心，爱尔兰科克市 999014)

采用超声波辅助碱处理提高米渣蛋白的溶解度。选择反应温度、超声波时间、超声波强度、蛋白浓度、NaOH浓度为优化因素,通过单因素和响应面分析,得到超声波辅助碱处理增溶米渣蛋白最佳工艺条件为:反应温度50 ℃、超声时间60 min、超声波强度19.2 W/cm2、米渣蛋白浓度5.1%(w/v)、NaOH浓度0.08 mol/L。在此条件下,改性后得到的米渣蛋白溶解度达(20.09±0.58) mg/mL(w/v)。SDS-PAGE结果表明蛋白的二硫键和亚基遭到破坏,处理过程中伴随着一些不溶性蛋白聚集体的溶解,且蛋白平均粒径由485 nm降低到223 nm,进而导致米渣蛋白溶解度显著增加。这些结果表明超声波辅助碱处理有助于进一步加工利用米渣蛋白,为食品的生产加工提供借鉴。

超声波,碱处理,米渣蛋白,溶解度

稻米是发展中国家最重要的粮食作物之一,提供了世界50%以上的人口食物中35%～59%的热量[1],同时也是主要的粮食加工原料之一。2011年数据显示,我国水稻总产量为2.025亿吨,居世界首位。稻谷加工过程中所产生大量的副产物——米渣,多以低廉的价格出售用于动物饲料,对其做进一步的开发利用较少。米渣作为一种优质的蛋白资源,其蛋白含量可达到50%以上,且氨基酸组成平衡,具有低过敏性及抗癌活性等特点[2-3]。从米渣中提取蛋白,作为新的蛋白原料在食品中使用,已有商业化产品,并由于其良好的营养价值而获得消费者的青睐。其蛋白质组成主要是胚乳蛋白,由清蛋白(4%～9%)、盐溶性球蛋白(10%～11%)、醇溶性谷蛋白(3%)和碱溶性谷蛋白(66%～78%)组成[4]。由于谷蛋白存在,导致其在中性条件下溶解度很低,继而影响了其它功能特性,限制了米渣蛋白在食品生产上的广泛应用。迄今,已有多篇采用物理方法或化学法改善米渣蛋白功能特性的报道,物理方法如热液蒸煮[5]、高速混合[6]和高压处理[7],化学方法有酶解[8]和酸法[9]等。

超声波技术已经广泛应用于食品加工中,具有安全可靠,费用低、作用时间短、对营养物质影响较小等优点[10]。Jambrak等的研究表明,频率为20 kHz、功率600 W的超声波处理大豆分离蛋白30 min能提高其溶解度[11]。Li等以米渣为原料,对米渣蛋白的超声波辅助碱处理提取技术做了探索,研究表明,该方法提高了疏水性氨基酸含量,改变米渣蛋白的微观结构,如颗粒的多孔性增多,粒径减小,从而提高了提取率[12]。然而,未见利用超声波辅助碱处理米渣提高蛋白溶解度的研究报道。

本文以从米渣中提取的食品级米渣蛋白商业产品为材料,以蛋白溶解度为主要指标,研究超声波辅助碱处理对米渣蛋白溶解度的影响,并采用响应面法优化处理条件,可为制备高溶解度的米渣蛋白提供数据参考,提高米渣蛋白的附加值,同时为超声波辅助碱处理技术在植物蛋白制备方面的应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米渣蛋白粉 食品级,江苏无锡金农生物科技有限公司;其它试剂 均为国产分析纯。

SDS-PAGE试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;Scientz-950E超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;Allegra X-30R台式冷冻离心机 美国贝克曼库尔特商贸有限公司;Nano ZS90激光粒度仪 马尔文仪器有限公司;Bio-Rad 电泳仪 伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 改性米渣蛋白的制备 准确称取一定重量的米渣蛋白置于250 mL夹套烧杯中,分散于100 mL一定浓度的NaOH溶液中,搅拌10 min后,将夹套烧杯连接恒温水槽,通过水循环使超声过程料液温度恒定在所设置的温度。按所需参数设置好超声波细胞破碎仪(20 kHz)的超声波的强度,工作时间为1 s,间歇时间1 s。经过设定好的超声波时间处理后,待样品冷却至室温后,用2 mol/L盐酸将溶液调至pH7.5,在10000×g,4 ℃条件下离心10 min,取上清液测量其溶解度。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 反应温度对米渣蛋白溶解度的影响 采用1.2.1法制备米渣蛋白,固定反应条件为超声波时间60 min、蛋白浓度5%、NaOH浓度0.08 mol/L、超声波强度19.3 W/cm2,考察反应温度(30、40、50、60、70 ℃)对米渣蛋白溶液溶解度的影响。

1.2.2.2 超声波时间对米渣蛋白溶解度的影响 采用1.2.1法制备米渣蛋白,固定反应条件为反应温度50 ℃、蛋白浓度5%、NaOH浓度0.08 mol/L、超声波强度19.3 W/cm2,考察超声波时间(30、45、60、75、90 min)对米渣蛋白溶液溶解度的影响。

1.2.2.3 蛋白浓度对米渣蛋白溶解度的影响 采用1.2.1法制备米渣蛋白,固定反应条件为反应温度50 ℃、超声波时间60 min、NaOH浓度0.08 mol/L、超声波强度19.3 W/cm2,考察蛋白浓度(w/v,1%、3%、5%、7%、9%)对米渣蛋白溶液溶解度的影响。

1.2.2.4 NaOH浓度对米渣蛋白溶解度的影响 采用1.2.1法制备米渣蛋白,固定反应条件为反应温度50 ℃、超声波时间60 min、蛋白浓度5%、超声波强度19.3 W/cm2,考察NaOH浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L)对米渣蛋白溶液溶解度的影响。

1.2.2.5 超声波强度浓度对米渣蛋白溶解度的影响 采用1.2.1法制备米渣蛋白,固定反应条件为反应温度50 ℃、超声波时间60 min、蛋白浓度5%、NaOH浓度0.08 mol/L,考察超声波强度(15.3、17.6、19.3、22.1、24.1 W/cm2)对米渣蛋白溶液溶解度的影响。

超声能量是超声波在机械作用过程中产生的能量,当超声波穿过介质时,这种能量会有部分以热能方式损失掉,使被超声的液体发热。因此,记录温度随时间变化,可以用来估计声能的大小,方程如下:

I=P/s,P=m·cp·(dT/dt)

其中,s是指所用超声波变幅杆的直径,m是指所超声溶液的质量,cp为溶液比热,dT/dt是指该曲线的斜率。加热过程中温度的升高可通过电子温度计记录,最终的超声强度用W/cm2表示,意为每平方厘米探头所能产的能量(W)。

1.2.3 Box-Behnken实验优化超声波辅助碱处理条件 在单因素的实验基础上,选取蛋白浓度、NaOH浓度和超声波强度三个对溶解度影响较大的因素,应用Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken设计实验，以溶解度作为响应值来确定其最优的处理条件。实验设计水平见表1。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 The variables employed in the Box-Behnken design

1.2.4 溶解度的测定 蛋白溶解度参考Jambrak[11]的方法进行测定。以牛血清蛋白绘制标准曲线,为y=0.008x+0.003,相关系数R2=0.9999,计算上清液中蛋白含量。所有测量三次重复。

1.2.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE) SDS-PAGE参照LaemmLi[13]的方法进行测定。

1.2.6 粒径的测定 蛋白的粒径使用马尔文粒度仪的动态光散射技术进行测定,测量温度为25 ℃,散射角度90°。所有测量重复三次,取其平均值。

1.3 数据分析

以上实验每个处理重复三次,结果取平均值。采用Microsoft Office 2007软件进行数据制图和统计分析。Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 反应温度对米渣蛋白溶解度的影响 由图1可知,蛋白溶解度随温度的升高而升高。温度较低时,蛋白质溶解缓慢,当温度大于30 ℃时,溶解度明显增加,但继续增高温度溶解度增加缓慢,这可能因为高温会破坏蛋白质结构[14],故选择反应温度为50 ℃左右较为合理。

图1 反应温度对米渣蛋白溶解度的影响Fig.1 Effect of temperature on the solubility of rice protein

2.1.2 超声波时间对米渣蛋白溶解度的影响 由图2可知,随超声波时间增加,其溶解度逐渐增加,当超声波时间大于60 min时,其溶解度增长缓慢,出于节约时间成本考虑,选取超声波时间为60 min进行后续实验。

图2 超声波时间对米渣蛋白溶解度的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the solubility of rice protein

2.1.3 蛋白浓度对米渣蛋白溶解度的影响 如图3所示,随蛋白浓度的增加可溶性蛋白浓度呈现先上升后下降的趋势。蛋白浓度在1%时,溶解度最低,为3.79 mg/mL;随蛋白浓度的增加,在5%处达到最大值,为11.67 mg/mL。当蛋白浓度大于5%时,米渣蛋白溶解度呈下降趋势。在预实验中,当蛋白浓度大于9%,蛋白质成糊状,流动性极差,这可能是由于在强碱性条件下,蛋白质发生变性,蛋白质分子聚集并形成有序的蛋白质网络结构,蛋白溶液粘度较大,分子扩散速率较低,不利于超声波的传导,且分子间的相互斥力阻碍更多蛋白的溶出[15]。袁道强和杨丽的研究表明,当蛋白溶液质量浓度高于一定值时,由于蛋白质的凝胶化作用,形成了溶胶,此时的蛋白溶液已经不是以一种真溶液的形式存在,而是大的蛋白质分子伸展后和水相互作用,使蛋白质更稳定的分散在水中,同时蛋白伸展形成的网络结构锁住了水分,故不利于超声波处理[16]。因此,确定5%的米渣蛋白浓度进行后续实验。

图3 蛋白浓度对米渣蛋白溶解度的影响Fig.3 Effect of protein concentration on the solubility of rice protein

2.1.4 NaOH浓度对米渣蛋白溶解度的影响 不同NaOH浓度对米渣蛋白溶解度的影响见图4。从图4中可知,NaOH浓度在0.02～0.08 mol/L时,米渣蛋白溶解度随碱浓度的升高而升高,最大溶解度达到19.79 mg/mL。在碱浓度高于0.08 mol/L之后蛋白的溶解度下降。王涛等研究发现,碱处理可将蛋白质的结构展开,使内部的亲水基团暴露在水溶液中,增强水与极性基团的相互作用,并将蛋白的部分亚基水解成低分子量的蛋白质[17]。碱处理一定程度上展开蛋白质的结构[18-19],使蛋白构象发生改变和解聚[14],超声波辅助处理所产生剧烈水力空化作用使碱处理的作用加强,使不溶性蛋白在水中分散性提高[20]。因此确定以NaOH浓度为0.08 mol/L进行后续实验。

图4 NaOH浓度对米渣蛋白溶解度的影响Fig.4 Effect of NaOH concentration on the solubility of rice protein

2.1.5 超声波强度对米渣蛋白溶解度的影响 超声波强度对米渣蛋白溶解度的影响见图5。由图5可知,随超声波强度的增大可溶性蛋白溶解度呈先上升后下降的趋势,在19.3 W/cm2处蛋白浓度达到最大值。王忠合等研究发现豌豆蛋白的溶解度随超声波强度的增大而增大[21],与本实验结果一致。超声波力空化瞬间产生极高的压强和温度[22-23],从而破坏蛋白质结构,极性基团暴露,导致水和蛋白质之间的相互作用增强,溶解度增大[24]。王涛等研究发现,冷冻粉碎辅助碱处理使米渣蛋白在pH12.5条件下的溶解度比未处理组增大42倍[17],其采用物理手段辅助提高碱处理提高蛋白质溶解度的结果与本研究类似。超声波可以进一步提高碱处理的效果在Li等的研究中也得到证实,该处理可有效地破坏蛋白质的分子结构,使更多的蛋白质分子溶解到溶液中[12]。

表3 响应面实验回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

图5 超声波强度对米渣蛋白溶解度的影响Fig.5 Effect of ultrasonic intensity on the solubility of rice protein

注:**为差异极显著(p<0.01),*为差异显著(p<0.05)。

2.2 米渣蛋白增溶工艺优化分析

以溶解度为检测指标,通过单因素实验,获得合理的因素水平进行响应面实验,以确定最佳的改性条件。Box-Benhnken实验结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计结果Table 2 Results of Box-Behnken design

方差分析结果如表3所示。使用软件Design-Expert对数据进行拟合,获得模型的二次多项回归方程为:

R=19.56+0.51A+0.97B+1.11C-0.33AB-0.58AC+1.09BC-4.05A2-4.57B2-3.69C2

从表3可知,模型的决定系数R2=0.9929,由方差分析可知,模型的p<0.0001,模型极显著,说明该模型与实际拟合良好,实验方法可靠,失拟项p=0.2995,失拟项不显著,说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小,可以用于对米渣蛋白增溶的工艺进行分析,并预测米渣蛋白溶解度随各因素的变化规律。由F值可知各因素影响结果的主次顺为C(超声波强度)>B(NaOH浓度)>A(蛋白浓度)。A、B、C、A2、B2、C2和BC交互项具有极显著性差异,AC交互项具有显著性差异。

2.3 各因素交互作用分析

为了更直观的找出最佳的工艺条件和分析各组因素间的交互作用,采用Design Expert 8.0.6软件对表2中实验结果进行模型分析,并绘制响应面的曲线图,见图6。

图6 两因素的交互作用对米渣蛋白溶解度的响应面图Fig.6 Response surface plots of variable parameters on the RRP solubility注:a:蛋白浓度和NaOH浓度对蛋白溶解度影响的等高线图和三维曲面图;b:超声波强度和蛋白浓度对蛋白溶解度影响的等高线图和三维曲面图;c:超声波强度和NaOH浓度对蛋白溶解度影响的等高线图和三维曲面图。

图6(a)结合交互项的显著性分析,可得出蛋白浓度和NaOH浓度两者对溶解度的交互作用不显著。图6(b)表明,蛋白浓度<4% 时,蛋白浓度对溶解度产生的影响显著,反之,蛋白浓度>4%,蛋白浓度对溶解度的产生影响逐渐减弱。等高线的轮廓呈现出斜向的椭圆形,说明超声波强度和蛋白浓度之间具有良好的交互作用。从图6(c)可知,超声波强度和NaOH浓度两者交互作用极显著。

2.4 验证实验

通过响应面分析软件Design Expert 8.0.6进行分析得到最优工艺条件,蛋白浓度5.09%、NaOH浓度0.08 mol/L、超声波强度19.2 W/cm2时,预测米渣蛋白的溶解度为19.73 mg/mL。为验证该条件是否可靠,结合实际操作,采用修正后的参数蛋白浓度5.1%、NaOH浓度0.08 mol/L、超声波强度19.2 W/cm2,超声波辅助碱处理米渣蛋白,重复实验3次得到的溶解度的平均值为(20.09±0.58)mg/mL,相比于响应面模型在最佳工艺条件下的预期结果,与预测值接近,偏差较小。

2.5 SDS-PAGE

谷蛋白部分主要由酸性亚基(谷蛋白-AS 30～39 kDa)和碱性亚基(谷蛋白-BS 19～25 kDa)组成,在分子量为10 kDa处的蛋白可能为醇溶性谷蛋白[25]。从图7可知,未经处理的米渣蛋白对照组的三条条带大致分布在分子量为35、19和11 kDa处,与O’Sullivan研究中的米渣蛋白电泳图条带分布一致[26]。经过超声波辅助碱处理后,各条带变淡、消失,说明蛋白质的二硫键和亚基可能遭到破坏,形成易溶的小分子肽类物质,这可能也是米渣蛋白的溶解度增加的原因之一[14,20]。

图7 蛋白的电泳图谱Fig.7 SDS-PAGE profiles of proteins

2.6 粒径的测定

蛋白质的粒径很大程度上影响着其溶解度的大小[27]。由图8可知,经超声波辅助碱处理后,分散液中的米渣蛋白平均粒径由485 nm降低到223 nm,其粒径Ⅰ区和Ⅱ区分布图明显向左偏移,说明所有区间的颗粒粒径均明显变小。结合图1～图5溶解度增加的结论可推测,超声波使米渣蛋白粒径降低是蛋白的溶解度显著提高的因素之一,与Li等的研究结论一致[28]。

图8 蛋白粒径的变化Fig.8 Effects of UAA treatment on protein’s size

3 结论

研究在单因素和响应面设计优化实验基础上,建立了米渣蛋白溶解度的回归模型,由该模型得到米渣蛋白的最优增溶工艺条件:反应温度50 ℃、超声时间60 min、超声波强度19.2 W/cm2、蛋白浓度5.1%、NaOH浓度0.08 mol/L。在此条件下,改性后得到的米渣蛋白溶解度最大,达到(20.09±0.58)mg/mL。SDS-PAGE结果表明蛋白的二硫键和亚基遭到破坏,处理过程中伴随着一些不溶性蛋白聚集体的溶解,且其平均粒径由485 nm降低到223 nm,进而导致可溶性蛋白粒径下降,使米渣蛋白溶解度显著增加。

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权威·核心·领先·实用·全面

Process optimization of increase the solubility of rice residue protein by ultrasound-assisted alkali treatment

PAN Zheng1,2,MIAO Song1,2,3,SHEN Kai-qing1,2,CAI Xiao-hua1,2,ZHANG Long-tao1,2,3,*,ZHENG Bao-dong1,2

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.China-Ireland International Cooperation Center for Food Material Science and Structural Design,Fujian 350002,China; 3.Teagasc Food Research Centre,Moorepark,Fermoy,Co. Cork 999014,Ireland)

This study was to improve the solubility of rice residue protein(RRP)with ultrasound-assisted alkali treatment(UAA). The process parameters,including reaction temperature,ultrasoinc time ultrasonic intensity,protein concentration and NaOH concentration,were optimized with single factor test firstly and then optimized using response surface methodology. The optimized treatment condition were reaction temperature 50 ℃,ultrasonic time 60 min,ultrasonic intensity 19.2 W/cm2,protein concentration 5.1% and NaOH concentration 0.08 mol/L,the RRP solubility was improved to be(20.09±0.58)mg/mL. Results of SDS-PAGE showed that the disulfide bond and subunit of RRP were subjected to destruct,the insoluble protein aggregates was dissolved by the UAA treatment. Determination of particle size showed that the protein size decreased significantly from 485 nm to 223 nm. All above attributed to the solubility improvement. These results indicated that UAA treatment was beneficial for promoting RRP processing techniques,it might be a promising manufacturing technique in food industry.

ultrasound;alkali treatment;rice protein;solubility

2017-02-07

潘征(1992-)，男，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：392903095@qq.com。

*通讯作者:张龙涛(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食品材料与结构设计，E-mail：zlongtao@hotmail.com。

TS210.1

B

1002-0306(2017)14-0232-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.045