基于AgNCs-Ce:ZONPs发光复合纳米材料的电致化学发光免疫传感器对肿瘤标志物灵敏检测的研究

陈茂鑫，周 莹，袁 若

（西南大学化学化工学院，重庆400715）

基于AgNCs-Ce:ZONPs发光复合纳米材料的电致化学发光免疫传感器对肿瘤标志物灵敏检测的研究

陈茂鑫，周 莹，袁 若*

（西南大学化学化工学院，重庆400715）

该研究以含有铈的氧化锌复合纳米材料（Ce:ZONPs）为固载基质，以BSA作为模板和还原剂在Ce: ZONPs表面原位合成银纳米簇（AgNCs）制得发光复合纳米材料（AgNCs-Ce:ZONPs），并以此作为信号探针构建了电致化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）免疫传感器用于癌胚抗原（CEA）的灵敏检测。在该工作中，BSA作为天然蛋白质，表面含有大量的氨基和巯基，介于共价键Ag-N和Ag-S，BSA可以作为优良的纳米簇配体。同时通过BSA的成膜性，制备BSA功能化的Ce:ZONPs，从而在Ce:ZONPs@BSA的表面生成大量、粒径小于2 nm的AgNCs，获得高效、稳定的电致化学发光。最后利用该复合物上BSA剩余的氨基与anti-CEA（Ab2）中的羧基交联，从而制备出AgNCs-Ce:ZONPs/Ab2探针。电极敏感界面的构建是在裸玻碳电极上修饰一层功能化BSA的TiO2纳米复合物（TiO2@BSA），提供充足的活性位点来固载anti-CEA（Ab1），从而制得了ECL免疫传感器。基于夹心型反应模式，此免疫传感器实现了对CEA的灵敏检测，线性范围2.5 ng/mL至80 ng/mL。

银簇；发光复合纳米材料；夹心免疫法；癌胚抗原；电致化学发光

0 引言

癌 胚 抗 原[1-3]（carcino-embryonic antigen CEA）是一种分子量为150～300 kD的糖蛋白，主要是由胎儿时期的内胚层衍生出来的胃肠道及肝胰合成。CEA是临床上极有价值的肿瘤标志物之一，当某些恶性肿瘤细胞基因受到损伤后，可能重新启动有关蛋白质的合成，致使肿瘤患者血清中CEA的浓度升高。因此，测定肿瘤患者血清中CEA的浓度，对于监测肿瘤的复发、转移等有一定的参考价值。

迄今为止，检测CEA的化学方法主要有荧光免疫分析法[4]、化学发光酶免疫分析法[5]、电化学发光免疫分析法等[6]。荧光免疫分析法存在的主要问题是抗原或者抗体在标记发光物质后发生特异性免疫反应后的性能可能改变，并且每次标记发光物质的标记率很大。化学发光酶免疫分析保留了化学发光的高灵敏度，但是酶的催化效果受外界条件的影响较大，不稳定。而电致化学发光免疫分析有其突出的优点，如标记物稳定，灵敏度高，可实现多元检测及均相免疫分析，因而日益受到重视。目前已经广泛应用于抗原、半抗原及抗体等的免疫检测。

电致化学发光分析[7]（ECL）是对电极施加一定的电压，电化学发光物质在电极表面发生电子传递反应而产生电化学发光物质的激发态，当激发态跃迁回到基态时辐射出光子发光，最后用光电倍增管捕获和测量发光光谱和强度，进而对物质进行痕量分析的一种方法。电致化学发光技术是电化学与化学发光相结合的检测技术，它具有仪器设备简单、操作方便、易于实现自动化、灵敏度高、选择性高、重现性好、抗干扰能力强、线性响应范围宽和分析速度快等特点。常见的电致化学发光试剂[8]主要有Ru(bpy)32+及其衍生物[9]、Luminol[10]及其衍生物和半导体纳米材料、贵金属纳米簇如银簇（Silver cluster,AgNCs）等。但是常用的量子点，如CdTe，CdS，CdSe等，其固有的毒性在一定程度上限制了量子点在生物中的应用，因此，发展新的低毒或无毒的具有电致化学发光（ECL）性质材料至关重要。贵金属纳米簇由于量子限域效应，具有不连续的尺寸相关的电子能级，因而表现出类分子性质，如较高的催化活性、荧光等，这使得银纳米簇在理论研究和实际应用中表现出巨大的潜力[11]。此外，银纳米簇还具有一些优越的性质，如制备简单，实用性好，低毒性，生物相容性，表面功能化简单以及良好的稳定性，这些性质极大地扩大了银纳米簇在生物分析中的应用前景。

该文以CEA为蛋白质模型，构建了一种基于AgNCs的电致化学发光超灵敏免疫传感器。该实验首先合成BSA功能化的Ce:ZONPs，随后利用BSA外面的氨基和巯基与Ag+通过Ag-N和Ag-S键连接，制备出AgNCs-Ce:ZONPs复合物，再利用该复合物上BSA剩余的氨基与anti-CEA（Ab2）中的羧基交联，从而制备出AgNCs-Ce: ZONPs/Ab2探针，该探针具有很强的ECL信号，用于提高检测的灵敏度，作为该实验的一大亮点，可以实现对一定浓度范围内的CEA检测。实验证明，根据此原理制备的电极可以有效的检测CEA，检测限低，灵敏度高，线性范围宽，结果令人满意。

免疫传感器的制备过程为：首先将功能化BSA的二氧化钛纳米复合物（TiO2@BSA）滴涂于干净玻碳电极的表面，由于TiO2具有较大的比表面积[12-13]从而增大了抗体固载量，同时能提供和人体相似的微环境以保持固定分子的生物活性。接着，由于氨基和羧基之间共价键作用，利用BSA和anti-CEA（Ab1）中的酰胺键作用来固定Ab1。利用夹心模型，一抗-抗原-二抗的作用，将AgNCs-Ce:ZONPs@BSA/Ab2生物探针固载到修饰电极表面，实现了对CEA的检测。该生物探针固载了大量的AgNCs发光试剂，结合较低浓度的过硫酸根（S2O82-）作为共反应试剂，得到强的ECL信号，提高传感器的检测灵敏度。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限公司、中科院长春应用化学研究所）；CHI610A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）；FA-2004A FA/JA系列电子天平（Metter Toledo公司）；BRANSONIC 200超声清洗仪（德国BRANSON ULTRASCHALL公司）；烘箱；反应釜移液枪（成都方舟科技开发公司）。JBZ-12H磁力搅拌器；三电极体系：玻碳电极（GCE，Φ=4mm）及其修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极。癌胚抗原酶结合物（Ab1, Ab2）和癌胚抗原（CEA）（郑州赛博生物工程有限责任公司提供）；磷酸盐缓冲液 （PBS）（pH= 7．4，0．1mol/L）；AgNO3、Zn(NO3)2、Ce(NO3)2、半胱氨酸（0．1mol/L）、赖氨酸（0．1mol/L）、铁氰化钾（化学试剂有限公司 （中国四川））、牛血清白蛋白（BSA,96%～99%）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC）（延长生化技术有限公司-上海）,N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）（延长生化技术有限公司-上海），甲胎蛋白（AFP）（郑州博赛生物技术股份有限公司），Na2S2O8（上海康达氨基酸厂）、草酸钛钾、双氧水（30%）、氢氧化钠（1 mol/L）、浓盐酸、硼氢化钠、醋酸，其他试剂如Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl均为分析纯试剂。实验用水均为二次去离子水。

1.2 AgNCs的制备

AgNCs根据先前报道的方法[14],经过适当修改合成。首先用二次去离子水配置10mLZn(NO3)2溶液（6mmol/L）、500μLCe(NO3)3溶液、1mL半胱氨酸 （0．1mol/L），随后在80°C下混合搅拌2 h，然后向其中加入5mL赖氨酸（0．1mol/L）,搅拌5min后，放入反应釜中，在180°C下反应2 h，便制得了Ce:ZONPs，自然冷却后，用二次去离子水离心洗涤两次，重新将Ce:ZONPs分散于二次去离子水中，放置于4℃保存备用。

其次，取500μLCe:ZONPs稀释至2mL，再加入2mL 3%BSA和EDC/NHS（1mg:4mg），4℃搅拌2 h，然后向其中滴加2 mL AgNO3（10 mmol/L）、100μLNaOH溶液（1mol/L），在25℃下搅拌12 h，用二次去离子水离心洗涤并分散于二次去离子水中，放置于4℃下避光保存。

1.3 AgNCs-Ce:ZONPs@BSA/Ab2生物探针的制备

取1．5mL已制备好的AgNCs-Ce:ZONPs@BSA加入干净的烧杯中，加入EDC/NHS（1mg:4mg）、二抗（Ab2）300μL，在4℃下避光搅拌过夜后，便制得AgNCs-Ce:ZONPs@BSA/Ab2溶液，离心后重新分散在二次去离子水中，置于4℃下避光备用。

1.4 TiO2@BSA复合纳米材料的制备

首先，在一个典型的过程中[15]，将8mL草酸钛钾直接溶解在8mL 30%的H2O2中，混合、搅拌5min,然后用浓盐酸调至pH=4,激搅30min，至溶液呈暗红色，放入反应釜中加热0．5 h，4℃冷藏备用。称取0．5 g BSA用适量水，超声震荡使之完全溶解后定容至10mL刻度，制备得到5%的BSA溶液，4℃冷藏备用。取1mLBSA加入到3 mL二氧化钛中，25℃下搅拌2 h后，制得TiO2@BSA复合纳米材料。

1.5 传感器的制备

玻碳电极（Φ=4mm）经0．3、0．05μm的Al2O3糊抛光2min后用蒸馏水冲洗干净，再在蒸馏水水中超声洗涤3min，清洗后的电极置于室温下晾干备用。

吸取5μL TiO2@BSA分散好的溶液滴涂于预处理后的玻碳电极表面，于室温下（在适当的温度下稍微用灯光加热可加快成膜）晾干成膜。在得到的修饰电极表面滴加10μL的Ab1，在4℃下孵育12 h，用蒸馏水淌洗，在电极表面滴加10μL不同浓度的CEA，孵育2 h后淌洗，于电极上滴入10μL AgNCs-Ce:ZnO@BSA放置1 h后淌洗，制得修饰电极。传感器的制备过程如图1。

1.6 测试方法

该实验测量采用三电极体系：玻碳电极（Φ= 4mm）为工作电极，Ag/AgCl（饱和KCl溶液）作为参比电极，铂丝为对电极。 在2mL含有0．01 mol/LNa2S2O8的0．1mol/LPBS（pH=7．4）溶液中，采用MPI-A型电致化学发光分析系统对所修饰电极的电致化学发光行为进行研究。电位扫描范围为-2 V～0 V，以100mV/s电位扫描速度施加循环伏安（CV）扫描模式和电致化学发光（ECL）检测，除特别说明温度均控制为室温。

2 结果与讨论

2.1 Ce:ZONPs形貌表征

将AgNCs-Ce:ZONPs@BSA进行SEM表征，由图2可以观察到，Ce:ZONPs明显的呈现圆球状，直径略大于1μm。

2.2 修饰电极的CV表征和ECL表征

图1 ECL免疫传感器的制备过程示意图Fig.1 The schematic diagramsof the ECL immunosensor

图2 Ce:ZONPs的SEM表征Fig.2 Ce:ZONPscharacterization ofSEM

在含有0．1mol/L的Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中，-0．2 V～0．6 V的电位范围内进行循环伏安（CV）电化学表征。在2 mL含有0．01 mol/L Na2S2O8的0．1mol/LPBS（pH=7．4）溶液中,-2 V～0 V的电位范围内进行电致化学发光（ECL）检测。由图3可以观察到，裸电极（曲线a）在测试底液中有一对对称的可逆氧化还原峰。在修饰了TiO2@BSA后，电极（曲线b）响应有一定幅度的降低,因为TiO2@BSA阻碍了电子传递率。当电极孵育Ab1后，由于蛋白质大分子阻碍了电子传输，电流减弱（曲线c），且ECL信号弱（曲线e）。当电极孵育上CEA后，与抗体Ab1结合发生特异性免疫反应形成免疫复合物，进一步阻碍了电子传输，峰电流值降低（曲线d）。当电极孵育上Ab2复合物后，该传感器具有很好的ECL信号（曲线f）。

2.3 免疫传感器的响应性能

在最优条件下，采用电致化学发光对免疫传感器的响应性能进行考察。如图4所示。将修饰了不同浓度CEA的免疫传感器（Ab2/AgNCs/Ce: ZnOPs@BSA/CEA/Ab1/TiO2@BSA）在0.01 mol/L的Na2S2O8溶液中进行检测，测得对应的稳定后的ECL强度随着抗原浓度的不断增加而逐渐增加。该传感器在2.5 ng/mL至80 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，其线性回归方程：I＝-249 lg c+4071（c为CEA的浓度ng/mL），相关系数为r =0.9974，检测限为0.83 ng/mL，信噪比为S/N=3。

2.4 免疫传感器的选择性

此外，对传感器的选择性进行了考察。将传感器的目标物分别更换为4%的AFP、空白、40 ng/mL的CEA以及三者的混合物。从图5可以看出，含有CEA的目标物具有很好的ECL信号，而不含CEA的目标物几乎没有信号，表明该免疫传感器具有很好的选择性。

2.5 免疫传感器的稳定性

同时，还对该免疫传感器的操作稳定性进行了评估。将免疫传感器在0.01mol/L缓冲溶液中进行连续10圈的ECL扫描。从图6可以看出，其ECL响应的相对标准偏差（RSD）为0.61%，表明传感器对CEA的检测具有良好的稳定性。

2.6 加标回收

图3 A传感器的CV表征（a.裸电极；b.TiO2@BSA/裸电极；c.Ab1/TiO2@BSA/裸电极；d.ECA/Ab1/TiO2@BSA/裸电极）；B传感器的ECL信号（a.ECA/Ab1/TiO2@BSA/裸电极；b.Ab2/ECA/Ab1/TiO2@BSA/裸电极）Fig.3 ACyclic voltammogramsofvariousmodified electrodes in 0.1mol/LK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6solution: (a)bareGCE;(b)TiO2@BSA/GCE；(c)Ab1/TiO2@BSA/GCE;(d)CEA/TiO2@BSA/GCE;BECLsignal: (a).CEA/Ab1/TiO2@BSA/GCE；(b).Ab2/CEA/Ab1/TiO2@BSA/GCE

图4 A ECL信号（CEA的浓度分别为a.2.5 ng/mL，b.5 ng/mL，c.10ng/mL，d.20 ng/mL，e.40 ng/mL，f.80 ng/mL）;B线性拟合图表Fig.4 A ECL signal(CEA concentrationwerea.2.5 ng/mL,b.5 ng/mL,c.10 ng/mL,d.20 ng/mL,e.40 ng/mL, f.80 ng/mL);B Linear fitting chart

图5 ECL信号选择性（CEA溶液的浓度为40 ng/mL）Fig.5 ECL signalselectivety(CEA solution concentration were40 ng/mL)

图6 ECL信号稳定性（CEA溶液的浓度为10 ng/mL）Fig.6 ECL signalstability(CEA solution concentration were 10 ng/mL)

通过重现性实验评估了该新开发的癌胚抗原生物传感器的应用潜力。实验操作为：先将癌胚抗原用健康人类血清样稀释至不同浓度，然后，孵育在生物传感器的敏感界面上，通过ECL检测，从而评估血清样本对癌胚抗原的影响。实验结果如表1所示。重现值控制在91．56%到106．73%之间,这表明,用该生物传感器检测血清样本的癌胚抗原是有应用潜力的。

表1 临床血清样本分析Tab.1 Clinicalserum sam p lesanalysis

3 结论

综上所述，该文利用Ce:ZONPs作为AgNCs固载基质合成了一个新型信号探针AgNCs-Ce: ZONPs，并构建了高灵敏的免疫传感器实现了对CEA的检测。值得一提的是，通过BSA中大量的巯基和羧基在Ce:ZONPs的表面合成AgNCs，与此同时，通过酰胺化反应合成AgNCs-Ce:ZONPs/ Ab2最后通过抗原抗体的特异性结合，实现了将银簇固载在电极上，并且在S2O82-的催化下传感器获得良好的ECL相应。基底材料TiO2具有大比表面积和良好的生物兼容性，使得修饰电极表面能吸附大量抗体并很好地保持其生物活性，基于夹心免疫反应，CEA免疫传感器在2．5 ng/mL～80 ng/mL检测范围内令人满意的分析性能，以及良好的稳定性。鉴于上述优点，该免疫传感器将在疾病诊断和临床分析领域具有较大的应用潜力。

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Electrochem ilum inescence immunoassay for sensitive detection of cancermarkersbased on AgNCs-Ce:ZONPs lum inescent nanocom posites

Chen Mao-xin,Zhou Ying,Yuan Ruo*
(SchoolofChemistry and ChemicalEngineering,SouthwestUniversity,Chongqing 400715,China)

In thiswork,the electrochemiluminescentnanocompositewas proposed through AgNCs in situ generating on the surface ofbovine serum albumin(BSA)functionalized zinc oxide containing cerium.Notably,BSA as stabilizing agentprovided abundantbinding sites to potentially bind and further reduce Ag ions for generating AgNCs. The AgNCs-TiO2NFs composites achieved highly efficient ECL,biocompatibility,ease of labeling and easy filmforming.In view of these advantages,the compositescould have greatpotentialasa signalprobe to constructelectrochemiluminescence(ECL)immunesensor for detection of carcinoembryonic antigen(CEA).Meanwhile,the nanocomposites(TiO2@BSA)weremodified onto the surface ofa glassy carbon electrode(GCE),which afforded a large surface area foranchoringmassive Ab1 via CO-NH bonding.Based on the“sandwich reaction”strategy,this immunesensorprovided an ultrasensitive ECL detection ofCEAwith a linear response from 2.5 ng/mL to 80 ng/mL.

AgNCs;luminescent nanocomposites(AgNCs-Ce:ZONPs@BSA);sandwich immunoassay;CEA; electrochemiluminescence(ECL)

*通信联系人,E-mail:yuanruo@swu.edu.cn