鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗(MG7株)最小有效免疫剂量的研究

罗琼，李延鹏，王宏飞，同戈，张晓楠，朱启运，李慧敏，陈瑞爱*

(1.华南农业大学兽医学院，广州510642; 2.广东省兽用生物制品生物技术研究与企业应用重点实验室,广东肇庆526238；3.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州730046)



鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗(MG7株)最小有效免疫剂量的研究

罗琼1,2，李延鹏2，王宏飞2，同戈2，张晓楠2，朱启运3，李慧敏1，陈瑞爱2*

(1.华南农业大学兽医学院，广州510642; 2.广东省兽用生物制品生物技术研究与企业应用重点实验室,广东肇庆526238；3.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州730046)

为科学指导鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗(MG7株)的临床免疫剂量，通过测定免疫鸡HI抗体滴度和攻毒保护试验，进行了10日龄和30日龄SPF鸡最小有效免疫剂量的研究。动物实验使用10 μL、20 μL和40 μL三种不同免疫剂量，免疫疫苗后21 d检测HI抗体效价，10日龄SPF鸡001批次疫苗HI抗体平均效价依次为4.8、6.2和6.5，攻毒保护率依次为80%、100%和100%，30日龄SPF鸡HI抗体平均效价依次为5.0、6.3和6.5，攻毒保护率依次为70%、100%和100%。结果表明，新城疫灭活标记疫苗(MG7株)HI 抗体效价和保护效力呈正相关, 免疫剂量与HI 抗体效价和保护效力也呈正相关。用NDV基因Ⅶ型强毒G7株进行攻毒保护试验，两种日龄鸡在20 μL的免疫剂量下，疫苗仍能达到良好的免疫保护效果。

鸡新城疫灭活标记疫苗；基因Ⅶ型；最小有效免疫剂量

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起禽类的一种高度接触性传染病，该病具有发病急、死亡快和死亡率高等特点，给养鸡业造成了巨大的经济损失，严重影响养禽业的发展。不同NDV分离株间的毒力差异大，严维巍等[1]在2000年首次报道了基因Ⅶ型NDV在中国大陆的存在。2001年刘华雷等[2]选取1994年以来国内不同地区的代表株进行遗传分析证实，所分离的毒株在裂解位点的氨基酸序列均符合NDV的强毒株特征，通过遗传进化树分析表明，选取的8株病毒中有7株为基因Ⅶ型新城疫病毒。虽然基因Ⅶ型NDV 的毒力指标和其他强毒株相似，但该型毒株感染鸡的脾脏、胸腺、法氏囊及盲肠扁桃体的病变程度均明显高于II 型和V 型毒株[3]。因此研制基因Ⅶ型NDV疫苗十分必要。

兰州兽医研究所于2008年在广东省某养鸡场发病鸡只中分离得到一株NDV，命名为NDV/Chicken/Guangdong/2008/G7(Newcastle disease virus G7，简称NDV G7)，利用NDV F基因1～374 bp核苷酸分型发现，该分离株为NDV基因Ⅶd亚型[4]。利用已建立的反向遗传操作平台，将基因Ⅶ型NDV强毒 G7株的NP蛋白缺失18个氨基酸，并对F蛋白裂解位点进行突变，获得NDV低毒力标记疫苗毒株MG7株，该毒株毒力明显减弱，NP蛋白缺失18个氨基酸可与野毒株有明显区分(可以做为标记疫苗使用)，对病毒的基因修饰不影响其在鸡胚上的复制能力，该毒株适合于ND疫苗的大规模生产，可用于制备基因Ⅶ型新城疫标记疫苗。本研究进行了鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)对鸡的最小有效免疫剂量的测定试验，为疫苗每羽份剂量的确定提供依据。

1 材 料

1.1 试验用疫苗 实验室制备的3批鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)，批号为001、002、003，2～8 ℃保存。

1.2 SPF鸡 SPF鸡由广东温氏大华农生物科技有限公司禽蛋分公司提供，动物房隔离器内按SPF鸡饲养要求饲养，供试验使用。

1.3 检验用试剂 MG7抗原和阳性血清由兰州兽医研究所制备保存。

1.4 效检用鸡新城疫病毒 鸡新城疫基因Ⅶ型强毒G7株由兰州兽医研究所分离纯化并保存。

2 方 法

2.1 不同剂量疫苗免疫试验 取10日龄SPF鸡100只随机分成10组，每组10只鸡。编号1-10组。其中第1-3组免疫批号为001的鸡新城疫灭活标记疫苗，免疫剂量依次为10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第4-6组免疫批号为002的鸡新城疫灭活标记疫苗，免疫剂量依次为10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第7-9组免疫批号为003的鸡新城疫灭活标记疫苗，免疫剂量依次为10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第10组为空白对照。取30日龄SPF鸡100只，免疫剂量和分组情况均与10日龄SPF鸡相同。

2.2 抗体水平测定 在鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)接种当天和接种后21 d，分别采血，分离血清。用MG7抗原检测免疫当天ND的HI抗体水平及免疫后21 d的ND HI抗体水平，求出几何平均值。

2.3 攻毒保护试验 采取与1.2.1 同样的分组方法，取10日龄SPF鸡100只随机分成10组，每组10只鸡。编号1-10组。其中第1-3组免疫批号为001的鸡新城疫灭活标记疫苗，免疫剂量依次为10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第4-6组免疫批号为002的鸡新城疫灭活标记疫苗，免疫剂量依次为10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第7-9组免疫批号为003的鸡新城疫灭活标记疫苗，免疫剂量依次为10 μL、20 μL和40 μL每羽份，第10组为空白对照。取30日龄SPF鸡100只，免疫剂量和分组情况均与10日龄SPF鸡相同。免疫后21 d，免疫组和攻毒对照组注射G7强毒，肌肉注射0.5 mL每羽(含105ELD50)，攻毒后观察有无新城疫临床症状，观察14 d，测定雏鸡对新城疫强毒攻击的被动免疫保护效力。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子接种SPF鸡胚进行病毒分离，对病毒分离阴性的，应在SPF鸡胚盲传一代后进行判定。

3 结 果

3.1 抗体水平测定 10日龄SPF鸡使用不同剂量免疫鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)，21 d时进行HI抗体测定，免疫试验结果显示3批次实验室试制的疫苗在40 μL免疫组的HI抗体效价大于6.5，20 μL免疫组的HI抗体效价大于6.2，10 μL免疫组的HI抗体效价不高于5.5，结果表明ND 灭活疫苗HI 抗体效价与免疫剂量呈现正相关(表1)。

鸡日龄免疫剂量/μL疫苗批号HI抗体鸡日龄免疫剂量/μL疫苗批号HI抗体10日龄100014.8±0.540025.5±0.530035.1±0.39200016.2±0.590026.4±0.390036.2±0.35400016.5±0.410026.8±0.350036.6±0.39空白对照/1±0.4730日龄100015.0±0.330025.3±0.480035.6±0.5200016.3±0.540026.4±0.390036.1±0.46400016.5±0.330027.0±0.370036.8±0.54空白对照/1.1±0.32

/空白对照组鸡全部健活

/Chickens of blank control group were all alive

3.2 攻毒保护试验 攻毒试验结果表明，免疫剂量与HI 抗体效价和抗攻毒保护效果呈正相关。20 μL免疫组即可有效抵御新城疫强毒G7株的攻击，攻毒对照组5 d内全部死亡，20 μL及以上免疫剂量组全部获得保护。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子进行病毒分离，40 μL免疫组均未分离到病毒；20 μL免疫组有1只鸡可以分离到病毒；10 μL免疫组有3只鸡可以分离到病毒(表2)。

30日龄SPF鸡以不同剂量免疫鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)，21 d时进行HI抗体测定，ND 灭活疫苗HI抗体效价与免疫剂量呈现正相关，3批次实验室试制的疫苗在40 μL免疫组的HI抗体效价均大于6.5，20 μL免疫组的HI抗体效价均大于6.1，10 μL免疫组的HI抗体效价不高于5.6。攻毒试验结果表明，免疫剂量与HI抗体效价和抗攻毒保护呈正相关。20 μL免疫组，能有效抵御新城疫强毒G7株的攻击，攻毒对照组5 d内全部死亡，20 μL及以上免疫剂量组全部获得保护。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子进行病毒分离，40 μL免疫组均未分离到病毒；20 μL免疫组有2只鸡可以分离到病毒；10 μL免疫组有2只鸡可以分离到病毒(表2)。

上述结果表明，10日龄和30日龄SPF鸡，在20 μL免疫剂量下，接种后21 d HI抗体效价达到6以上，利用新城疫基因Ⅶ型强毒G7株攻毒后，可以获得100%保护，病毒分离阳性率不高于20%。

表2 不同日龄SPF鸡攻毒保护试验Tab 2 Challenge protection test of SPF chickens at different ages

/攻毒对照组在攻毒后5 d内全部死亡

/Chickens of the poison control group were all dead within 5 days after the attack

4 讨 论

目前国内外使用的疫苗株LaSota为基因II型，距今已有70 多年的历史。NDV持续进化过程中出现了多个基因型，在临床使用中常发生疫苗株与流行毒株基因型不一致的情况，这也是免疫鸡群中发生非典型ND 的主要原因。使用与流行毒株相同基因型的疫苗株可有效预防NDV 流行强毒株的感染[5]。疫苗的好坏能直接影响免疫保护期的长短及免疫效果，而疫苗里边抗原含量是疫苗质量的重要指标，进入动物机体的抗原需要有一定的数量才能刺激机体产生免疫应答，这个量的大小取决于抗原的抗原性强弱，好的抗原少量即可刺激机体产生强烈的免疫反应，产生高水平的免疫抗体，提供良好的免疫保护。提高抗原量能增强免疫效力，过量则引起免疫副反应也增加成本，确定最小有效免疫剂量为疫苗使用给用户提供理论依据，做到既确保免疫有效，又不增加副反应和成本。

本研究利用不同日龄(10日龄和30日龄)的SPF鸡进行了鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)的最小有效免疫剂量研究，结果表明，疫苗免疫剂量与HI 抗体效价和攻毒保护效果呈正相关。对于两种日龄的SPF鸡，鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)免疫20 μL及以上剂量时，HI抗体效价均大于6，攻毒保护效率100%。同期利用LaSota疫苗(与MG7疫苗采用相同工艺制备)20 μL免疫组，21 d后的HI抗体效价(利用LaSota抗原测定)仅为4～5(待发表数据)，表明研制的MG7株疫苗可以诱导更高的ND抗体效价。

攻毒试验结果显示，免疫剂量为20 μL，不同日龄鸡群均能抵抗流行的基因Ⅶ型强毒G7 的攻击，而对照组最终全部发病死亡，显示出了该疫苗在控制我国新城疫的流行中具有广阔的应用前景。通过对鸡新城疫灭活标记疫苗(MG7株)的最小有效免疫剂量研究，我们在临床使用中可以更加科学合理的使用免疫剂量，以确保疫苗安全有效。

[1] 严维巍,王永坤,周继宏,等.一株鸡副粘病毒的分子特性研究[J].扬州大学学报(自然科学版),2000,3(1):27-31.

Yan W W, Wang Y K, Zhou J H,etal. Molecular characterization of an unassigned avian paramyxovirus isolate[J]. Journal of Yangzhou University (Natureal Science Edition), 2000,3(1):27-31.

[2] 刘华雷,王永坤,严维巍,等.中国部分地区新城疫病毒的分子流行病学研究[J].扬州大学学报(自然科学版),2001,4(1):35-40.

Liu H L, Wang Y K, Yan W W,etal. The Investigation on the molecular epizootiology of Newcastle disease virus [J]. Journal of Yangzhou University (Natureal Science Edition), 2001,4(1):35-40.

[3] Susta L, Miller P J, Afonso C L,etal. Clinicopathological characterization in poultry of three strains of Newcastle disease virus isolated from recent outbreaks[J]. Vet Pathol,2011, 48: 349-360.

[4] Liu B, Ji Y, Lin Z, Fu Y,etal. Two single amino acid substitutions in the intervening region of Newcastle disease virus HN protein attenuate viral replication and pathogenicity[J]. Scientific reports 2015, 5:13038.

[5] Miller P J, King D J, Afonso C L,etal. Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge[J]. Vaccine, 2007, 25: 7238-7246.

(编辑：李文平)

Study on the Minimum Effective Immune Dose of Genotype VII Newcastle Disease Inactivated Marker Vaccine (MG7 strain)

LUO Qiong1,2,LI Yan-peng2,WANG Hong-fei2,TONG Ge2,ZHANG Xiao-nan2,
ZHU Qi-yun3, LI Hui-min1,CHEN Rui-ai1,2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642，China; 2.GuangdongEnterpriseKeyLaboratoryofBiotechnologyR&DofVeterinaryBiologicalProducts，Zhaoqing，Guangdong526238，China； 3.LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046，China)

CHENRui-ai,E-mail:chensa727@126.com

In order to scientifically guide the clinical immunization dose of genotype VII Newcastle disease inactivated marker vaccine (MG7 strain), the minimum effective immune dose of 10 days and 30 days SPF chickens was studied by measuring the immunized chicken HI antibody and challenge protection test. Animal experiment using 10 μL, 20 μL and 40 μL in three different doses of 3 batches of vaccine immune, The HI antibody titers were detected 21 days after immunization, the 10 day old SPF chickens of 001 batches of vaccine HI antibody titers were 4.8, 6.2 and 6.5, protective rates were 80%, 100% and 100%. The 30 day old SPF chickens of 001 batches of vaccine HI antibody titers were 5, 6.3 and 6.5, protective rates were 70%, 100% and 100%.The results showed that there was a positive correlation between the HI antibody titer and protective efficacy after vaccination, and the immunization dose was positively correlated with HI antibody titer and protective effect. The NDV genotype VII virulent G7 strain was used to challenge protection test. The vaccine was able to achieve good immunoprotective effect at 20 μL immunization dose.

Newcastle disease inactivated marker vaccine; genotype VII; minimum effective immune dose

广东省科技计划项目(2016B020202007) 作者简介： 罗琼，硕士研究生，从事生物制品方面的研究。

陈瑞爱。E-mail: chensa727@126.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.01

2017-03-01

A

1002-1280 (2017) 07-0001-05

S859.797