2014～2016年广州市屠宰场分离沙门氏菌血清学鉴定和耐药性分析

吴荔琴，刘佩怡，伍宏凯，方秋华，肖田安，梁祺琦，何滢

(广东省兽药饲料质量检验所，广州 510230)



2014～2016年广州市屠宰场分离沙门氏菌血清学鉴定和耐药性分析

吴荔琴，刘佩怡，伍宏凯，方秋华，肖田安*，梁祺琦，何滢

(广东省兽药饲料质量检验所，广州 510230)

2014～2016年从广州市屠宰场分离沙门氏菌151株，鉴定出12种血清型，前3位优势血清型分别为德尔卑沙门氏菌、罗森氏沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。采用微量肉汤稀释法测定分离菌株对13种抗菌药物的敏感性。结果显示，沙门氏菌对四环素、多西环素、磺胺异恶唑、氨苄西林、大观霉素的耐药率都在60%以上，对奥格门丁、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻呋、多粘菌素E敏感(耐药率≤16%)，多重耐药率为79.20%。研究表明，沙门氏菌对部分药物耐药性较严重，亟需加强养殖业抗菌药物的合理应用以控制耐药性的发展。

沙门氏菌；血清型；耐药性；屠宰场

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人畜共患病原菌，对人和动物的危害极大。2015年国家食品药品监督管理总局发布的《食品安全风险解析》，指出沙门氏菌居我国食源性疾病致病菌首位。2006～2010年间我国报告的病因明确的细菌性食源性疾病暴发事件中，70%～80%由沙门氏菌导致。美国食源性疾病主动监测网运用所建立的模型评估认为，美国每年有140万非伤寒沙门菌病例，导致16.8万人次就诊，1.5万人次住院和400人死亡。同样，在欧盟所有病因明确的食源性暴发事件中，由沙门氏菌引起的占比较高。该病原菌对人类健康影响风险较高、造成的经济损失和社会负担较大。沙门氏菌在人和动物中具有广泛的宿主，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接的途径进行传播。猪是沙门氏菌病原体的主要储存宿主，在屠宰的时候，猪胴体可能会被肠道中的沙门氏菌污染，从而引起人沙门氏菌感染，对公共卫生构成潜在威胁。随着中国养猪业的迅速发展和饲养的高度集约化，沙门氏菌已成为危害养猪业的重要细菌性疾病；抗生素的不合理使用导致沙门氏菌产生耐药性，耐药范围逐渐扩大，耐药程度也在逐渐增加[1-2]。因此,应实时监测畜禽产品中沙门氏菌耐药趋势的变化。本文拟调查2014～2016年广州市生猪屠宰场分离沙门氏菌的血清型及其耐药情况，以期为有效控制沙门氏菌的感染提供科学依据，保障公共卫生安全。

1 材 料

1.1 样品来源 2014～2016年从广州市生猪屠宰场进行每年一次的样品采集，样品为猪盲肠拭子，并分离、鉴定沙门氏菌。

1.2 培养基和药品 沙门氏菌显色培养基，法国科玛嘉公司；Amies运送培养基、营养琼脂、SC增菌液和TTB增菌液，均购自青岛海博公司；沙门氏菌核酸检测试剂盒，中山大学达安基因股份有限公司；药敏检测板，天津金章科技发展有限公司；沙门氏菌诊断血清，泰国S&A公司。

1.3 仪器设备 离心机，德国Eppendorf公司；荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；水浴锅，华普达教学仪器有限公司；灭菌器，日本Hirayama公司；涡旋振荡器，德国IKA公司。

1.4 质控菌株 鼠伤寒沙门氏菌CVCC 541，由中国兽医药品监察所提供。

2 方 法

2.1 菌株分离 对健康猪屠宰后的盲肠，剪一小口，将无菌拭子插入，粘取盲肠内容物，装入Amies运送培养基，8 h内分别接种到SC增菌液和TTB增菌液中，分别在36 ℃培养18～24 h和在42 ℃培养22～24 h，用接种环取增菌液划线接种于沙门氏菌显色培养基，将可疑菌落接种另一个沙门氏菌显色培养基进行纯化，将纯化的菌落接种于营养琼脂做进一步鉴定。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 DNA模板的制备 取1 mL无菌水加入2 mL离心管中，用10 μL接种环将可疑沙门氏菌适量挑入离心管中，涡旋震荡，12000 r/min离心5 min，去除上清液，加入0.5 mL无菌水，涡旋震荡，沸水浴10 min，冰浴10 min，离心5 min，取上清液作模板。同时阴性菌株和沙门阳性菌株均参与提取，并作为PCR检测试剂的质控。

2.2.2 PCR-荧光探针法测定 取适量PCR反应管，按照沙门氏菌核酸检测试剂盒说明书进行操作。

2.3 血清型鉴定 确定的沙门菌属，用沙门氏菌诊断血清进行分型。按照GB 4789.4-2010操作方法进行。

2.4 药敏试验 根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的标准，用微量肉汤稀释法测定沙门氏菌的药物敏感性，结果判定参照CLSI文件标准。操作参照药敏检测板说明书；对供试菌的最小抑菌浓度(MIC)进行判断和数据读取。测定药物共9类13种，包括：氧氟沙星、恩诺沙星、四环素、多西环素、庆大霉素、大观霉素、头孢噻呋、磺胺异恶唑、复方新诺明、氨苄西林、氟苯尼考、奥格门丁、多粘菌素E。同时做质控样品，质控菌株为鼠伤寒沙门氏菌CVCC 541。

3 结果与分析

3.1 菌落特征 沙门氏菌在显色培养基上形成淡紫色的圆形菌落。

3.2 PCR鉴定 根据沙门氏菌核酸检测试剂盒说明书判定，在阴性质控的扩增曲线无明显对数增长期或Ct值空白，阳性质控的扩增曲线有明显对数增长期或Ct值≤32的前提下，若样品的扩增曲线有明显对数增长期或Ct值≤36，则判样品为沙门氏菌。共分离沙门氏菌151株，其中2014年65株，2015年49株，2016年37株。

3.3 血清型 分离的151株沙门氏菌除12株不能分型以外，剩下的139株共鉴定出12种血清型。占主导的前5种血清型分别是：德尔卑沙门氏菌(49株，32.45%)、罗森氏沙门氏菌(29株，19.21%)、鼠伤寒沙门氏菌(28株，18.54%)、伦敦沙门氏菌(11株，7.28%)、斯坦利沙门氏菌(9株，5.96%)。每年鉴定出的主导血清型基本一致；但所占比例存在变化，少见或罕见血清型差异较大。2014～2016年沙门氏菌的血清型分布见表1。

表1 2014～2016年沙门氏菌的血清型分布Tab 1 Serotype distribution among Salmonella, 2014～2016

3.4 药敏结果 对151株沙门氏菌进行了9类13种抗菌药物的敏感性试验。从总体上来看，沙门氏菌对四环素(80.13%)、多西环素(77.48%)、磺胺异恶唑(71.52%)、氨苄西林(62.25%)、大观霉素(60.93%)的耐药率都在60%以上；其次是复方新诺明(48.34%)、氟苯尼考(37.75%)、庆大霉素(35.10%)的耐药率在40%左右；对奥格门丁(15.23%)、恩诺沙星(14.57%)、氧氟沙星(9.93%)较低；个别菌株对头孢噻呋(0.66%)耐药，无菌株对多粘菌素E耐药。连续3年耐药率下降的药物有氧氟沙星，连续3年耐药率上升的药物有庆大霉素、氨苄西林、氟苯尼考。151株沙门氏菌对9类13种抗菌药物的耐药性结果见表2。

3.5 多重耐药 151株沙门氏菌对9类药物的多重耐药率(耐药重数≥3)为79.20%，且有逐年上升的趋势；最高为7耐(3.97%)。其中，2014年以4耐(18.46%)和6耐(16.92%)为主，2015年以5耐(18.37%)和3耐(16.92%)为主，2016年以5耐(35.90%)和4耐(28.21%)为主。2014～2016年沙门氏菌多重耐药结果见表3。

表2 2014～2016年沙门氏菌耐药性情况Tab 2 Antimicrobial resistance among Salmonella, 2014～2016

表3 2014～2016年沙门氏菌多重耐药情况Tab 3 Multidrug resistance among Salmonella, 2014～2016

4 讨论与小结

本次研究分离到的菌株中占主导的前5种血清型分别是：德尔卑沙门氏菌(32.45%)、罗森氏沙门氏菌(19.21%)、鼠伤寒沙门氏菌(18.54%)、伦敦沙门氏菌(7.28%)、斯坦利沙门氏菌(5.96%)。该前3种优势血清型结果与岳秀英等[2]调查四川省猪源沙门氏菌的主导血清型基本一致，但所占比例存在差异。四川省以德尔卑沙门氏菌为主，所占比例为60.26%；其次是鼠伤寒沙门氏菌(16.56%)和罗森氏沙门氏菌(6.6%)。黄照清[3]等在调查肉品中沙门氏菌血清型时，发现占主导是德尔卑沙门氏菌，比例高达82%。加春生[4]等对哈尔滨地区健康猪场直肠采样分离沙门氏菌，经鉴定以猪霍乱沙门氏菌(71.4%)为主，其次是猪伤寒沙门氏菌(22.9%)和鼠伤寒沙门氏菌(5.7%)。黄裕[5]等在调查深圳市畜禽产品中沙门氏菌血清型时发现，猪肉中的优势血清是伦敦沙门氏菌(19.51%)和德尔卑沙门氏菌(14.63%)。说明不同地区占主导的猪源沙门氏菌血清型有所交叉，也存在差异。根据张霆[6]等调查东莞地区引起腹泻最常见的血清型主要是鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和斯坦利沙门氏菌等。曾健君[7]等在调查惠州市腹泻患者感染沙门氏菌血清型中发现，引起腹泻常见的血清型为鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。本研究调查屠宰场流行的血清型如鼠伤寒沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌等对公共卫生安全存在潜在威胁。

本研究中发现沙门氏菌对四环素、多西环素、磺胺异恶唑、氨苄西林、大观霉素的耐药率都在60%以上，其次是复方新诺明、氟苯尼考、庆大霉素的耐药率在40%左右，对奥格门丁、恩诺沙星、氧氟沙星的耐药率较低，在9%～16%之间，个别菌株对头孢噻呋(0.66%)耐药，无菌株对多粘菌素E耐药。与四川省猪源沙门氏菌[2]相比，本研究分离的沙门氏菌对多种药物的耐药水平显著较低。黄福标[8]等分离南宁市猪肠道中沙门氏菌，对氨苄西林(55.56%)、庆大霉素(20%)、氧氟沙星(6.67%)的耐药率较低，但对复方新诺明(80%)的耐药率较高。不同省份猪源沙门氏菌也呈现出了各自的耐药特点[9]，与兽医临床用药情况相关。同时，本研究发现，分离菌株对氧氟沙星的耐药率逐年下降，这可能与农业部2292号公告停止在食品动物中使用氧氟沙星存在相关性；且国家每年实施“氟喹诺酮类药物残留监测”计划，促使养殖场对该类药物的使用更加规范。但在连续3年监测中发现，对庆大霉素、氨苄西林、氟苯尼考等药物的耐药率一直在上升，耐药水平的上升可能与这三种药物在兽医临床使用广泛密切相关。

在151株沙门氏菌中有106株菌对3类及3类以上的药物存在耐药性，多重耐药率为79.20%；显著低于四川省猪源沙门氏菌(94%)[2]；与广西南宁市猪肠道中沙门氏菌多重耐药率(80%)[8]一致。但多重耐药率从2014年的74.62%上升到87.18%。

屠宰场是畜禽产品受沙门氏菌感染的一个重要场所，多重耐药沙门氏菌可能通过食物链传递给人类导致抗生素治疗的失败，对公共卫生的风险不可忽视。鉴于本研究的结果，亟需加强养猪业抗菌药物的合理使用，实时动态监测，有效遏制沙门氏菌耐药性发展，保障猪肉及猪肉制品的安全，进而保障消费者健康。

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(编辑：侯向辉)

Identification Serotype and Antimicrobial Resistance ofSalmonellafrom the Slaughter Houses in Guangzhou from 2014 to 2016

WU Li-qin，LIU Pei-yi，WU Hong-kai，FANG Qiu-hua，XIAO Tian-an*，LIANG Qi-qi，HE Ying

(GuangdongInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuffsControl,Guangzhou510230,China)

XIAOTian-an，E-mail：xta@gdivdc.com

A total of 151Salmonellastrains were isolated from the slaughter houses in Guangzhou from 2014 to 2016, and 12 serotypes were identified. Among the strains,S.derby,S.rissenandS.typhimuriumwere top 3 serotypes. Antimicrobial susceptibility amongSalmonellaisolates against 13 antimicrobial drugs was performed using microdilution method. The results showed that percents of resistance among the strains were more than 60% for tetracycline, doxycycline, sulfurazole, ampicilin, and spectinomycin, The strains were sensitive to amoxycilin/elavulanic acid, enrofloxacin, ofloxacin, ceftiofur, and polymyxin E (resistance rates were lower than 16% for these drugs). The multidrug-resistance rate was 79.20%. The researches show thatSalmonellastrains were seriously resistant to some drugs. It is urgent that the domestic industry should reasonably use antimicrobials to control the development of antimicrobial resistance.

Salmonella；serotype；antimicrobial resistance；slaughter house

吴荔琴，兽医师，从事细菌耐药性和兽药残留检测研究。

肖田安。E-mail：xta@gdivdc.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.04

2017-03-23

A

1002-1280 (2017) 07-0015-06

S852.61