黄芩苷对大鼠口服非索非那定的药动学影响

王斌，杨锐 ，李思聪，张敏，李金良，李旭廷*

(1.四川省畜牧科学研究院兽药研究所，成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066)



黄芩苷对大鼠口服非索非那定的药动学影响

王斌1,2，杨锐1,2，李思聪1,2，张敏1,2，李金良1,2，李旭廷1,2*

(1.四川省畜牧科学研究院兽药研究所，成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066)

为了研究黄芩苷对大鼠口服非索非那定药动学及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响，将SD大鼠36只随机分为A、B、C三组，连续灌胃7 d，A组给予黄芩苷200 mg/kg，B组蒸馏水空白对照，C组维拉帕米药物对照(10 mg/kg)，第8天灌胃后2 h，各组随机取6只大鼠处死，解剖并迅速取出肝脏、空肠，荧光定量PCR测定各组织P-gp的mRNA表达水平。各组另外6只大鼠灌胃后同时给予非索非那定(30 mg/kg)，按时间点连续采集血样，采用高效液相色谱法测定非索非那定血药浓度。结果表明，黄芩苷对非索非那定的吸收有明显促进作用，主要表现在黄芩苷组非索非那定峰浓度(Cmax)比空白对照组显著增加17.04%(P<0.05)，曲线下面积AUC(0-12)显著增加19.23%(P<0.05)，黄芩苷减少了大鼠空肠和肝脏P-gp的表达(P<0.05)。结论：黄芩苷能下调大鼠P-gp表达，增加P-gp底物非索非那定在大鼠体内的生物利用度，是一种P-gp抑制剂。

黄芩苷；非索非那定；药动学；荧光定量；P-糖蛋白

黄芩苷是黄芩中主要活性成分，属于黄酮类化合物，具有抗病毒、抗炎、免疫调节等作用[1-2]。黄芩苷与多种药物存在相互作用，其与化学药的相互作用问题越来越受到重视[3-5]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由1280个氨基酸组成的跨膜蛋白，在药物吸收、分布、代谢及排泄方面有重要的作用[6]。含有黄芩及黄芩苷的中药制剂在兽医临床应用非常广泛，研究黄芩苷对药物转运蛋白P-gp的影响对指导临床合理用药具有重要意义。本研究以非索非那定药动学参数作为体内P-gp活性的探针，通过观察黄芩苷对非索非那定大鼠体内药动学及肝脏和空肠P-gp表达的影响来探讨黄芩苷对P-gp活性的影响，为临床黄芩苷的药物配伍使用提供科学依据。

1 材 料

1.1 仪器 UltiMate 3000型高效液相色谱仪，美国戴安公司；WH-3微型漩涡混合仪，上海泸西分析仪器厂；Eppendorf MiniSpin plus离心机，德国Eppendorf 公司；CQ250超声洗涤器，上海超声仪器厂；MD200-1氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司。H6-1微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂；凝胶成像系统，北京君意；T6紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；PCR反应扩增仪，BIO公司； StepOne型荧光定量PCR仪，ABI。

1.2 试剂与药品 非索非那定对照品(批号：100852-201202)，非那西丁对照品(批号：100095-201205)，维拉帕米对照品(批号：100223-200102)，黄芩苷对照品(批号：110842-201207)，对照品购自中国食品药品检定研究院，甲醇、乙腈为色谱级，其它试剂为分析纯。Trizol提取试剂盒，4S Red Plus核酸染色剂，第一链cDNA合成试剂盒，上海生工生物工程有限公司。

1.3 试验动物 健康清洁级SD雄性大鼠，体重(200±20) g，由成都达硕实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(川)2013-24。整个试验期间，于室温20 ℃～24 ℃下饲养，每天供给饲料及纯化水，采血前12 h限饲。

2 方 法

2.1 试验分组 体重相近雄性大鼠36 只，随机分为3 组，每组12 只。灌胃给药，A组黄芩苷200 mg/kg；B组灌注相同体积的蒸馏水，C组灌注维拉帕米10 mg/kg，每日1次，所有受试大鼠连续灌胃7 d，12 h禁食后，第8天，各组随机挑选6只大鼠，灌药后2 h断颈处死，解剖并迅速取出肝脏、空肠，样品置液氮冻存待检。各组另外6只灌胃后，立即口服非索非那定30 mg/kg，分别于服药后0、0.083、0.25、0.5、0.75、l、1.5、2、3、4、6、8、12 h断尾采血，3000 r/min离心和分离血浆，-20 ℃保存备用。

2.2 血浆样品的处理 取血浆样品100 μL，加入等体积的乙腈，涡旋3 min，12000转离心5 min，取上清液置于另一离心管中，氮吹仪吹干，用流动相100 μL溶解，涡旋1 min，取20 μL进样。

2.3 液相色谱法测定非索非那定血药浓度 色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈∶0.5%磷酸二氢钾(pH3.8)：三乙胺(30∶70∶0.3)；流速：1.0 mL·min-1；UV检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，非索非那定与非那西丁、溶剂峰、血浆及其他组分能完全分开，该方法血浆的定量限为0.054 μg/mL。

血浆样品标准曲线范围在0.054～21 μg/mL之间，线性关系良好。在标准曲线范围内，回收率为99.7%～101.4%，批内变异系数和批间变异系数分别为2.67%～5.64%和3.12～4.85%。

2.4 荧光定量PCR检测大鼠肝、空肠P-gp表达 用于UNIQ-10 柱式 Trizol 总RNA抽提试剂盒提取各组样品RNA，按常规方法进行反转录，反应体系为25 μL，反转录产物-20 ℃保存备用。将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测，最终扩增反应按95 ℃预变性3 min，95 ℃变性7 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共45循环。所有样品检测均含有一个平行样本，并包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果，以GAPDH 管家基因作为内标，对基因P-gp的mRNA表达进行相对定量分析，将所得Ct按照2-(△△Ct)方法进行计算分析统计结果。

表1 实时荧光定量RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of real time fluorescent quantitative RT-PCR

2.5 数据分析 采用药动学分析软件DAS3.0，以非房室模型处理血浆浓度-时间数据，获得药动学参数，数据以平均数±标准差(x±s)表示，组间数据采用SPSS11.0统计软件进行t 检验。

3 结 果

3.1 药物动力学结果 各组大鼠体内的非索非那定血药浓度-时间曲线见图1，主要药物动力学参数结果见表2。结果表明，黄芩苷和维拉帕米诱导后，与对照组相比，非索非那定血药浓度-时间曲线下面积AUC(0-12)显著增加(P<0.05)，达峰浓度(Cmax)显著升高(P<0.05)，达峰时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、平均驻留时间MRT(0-12)、清除率(CLZ/F)各组差异不显著。

3.2 大鼠肝、空肠P-gp蛋白mRNA的表达 荧光定量RT-PCR检测结果见图2，维拉帕米和黄芩苷诱导对大鼠肝、肠的P-gp mRNA表达量有下调作用(P<0.05)，且维拉帕米的下调程度大于黄芩苷。

图1 各组灌胃后非索非那定的血药浓度-时间曲线 Fig 1 Plasma concertration-time curves of fexofenadine in the different groups(x±s，n=6)

参数ParametersA组AgroupB组BgroupC组CgroupCmax/(mg﹒L-1)7.190±1.182*6.143±0.7818.202±0.841*Tmax/h1.503±0.7861.526±0.1471.482±0.214AUC(0-12)/(mg·L-1·h)19.608±2.556*16.445±2.67720.468±2.452*t1/2/h2.343±0.4162.134±0.2052.148±0.337MRT(0-12)/h2.718±0.4682.903±0.3322.540±0.275CLZ/F/(L·h-1·kg-1)1.521±0.2031.495±0.1681.593±0.281

*0.05水平上差异显著

*Significant difference at 0.05 levels

* 0.05水平上差异显著* Significant difference at 0.05 levels图2 各试验组大鼠肝、空肠P-gp mRNA表达水平(x±s，n=6)Fig 2 expression level of P-gp mRNA in the live and jejunum of different group (x±s，n=6)

4 讨 论

黄芩苷为中药黄芩的主要活性成分之一，以黄芩提取物入药的制剂在兽医临床应用广泛，如双黄连注射液、银黄注射液、清开灵注射液等，且多以中西药配伍使用[7]，联合使用的药物大多具有药效的协同作用，同时也可能有相似代谢或转运途径，表现为药动学特征的改变，P-gp介导的相互作用最为常见。基于P-gp抑制机制的相互作用往往会使其底物的疗效增加，生物利用度提高，因此，对P-gp抑制剂药物的研究，在指导临床联合用药及解决多药耐药问题都具有重要意义。

Tsuruo等[8]证实维拉帕米对P-gp有抑制作用，可阻碍药物外排，提高细胞内药物浓度，改善治疗药物的体内生物利用度，而非索非那定是药物转运体P-gp 和有机阴离子转运体的底物，由于它在体内不被代谢，常用来作为体内评价P-gp 转运行为的探针药物[9]。本研究以维拉帕米作为阳性对照药物，以非索非那定作为体内P-gp的探针药物，通过观察黄芩苷对非索非那定药动学的影响，探讨黄芩苷对P-gp的影响。结果显示，维拉帕米对非索非那定主要药动学参数影响明显，Cmax和AUC(0-12)较空白组显著增加，表明维拉帕米提高了非索非那定在大鼠体内的生物利用度，呈现出P-gp抑制剂的特性。黄芩苷对非索非那定的药动学参数的改变趋势与维拉帕米一致，提示黄芩苷可能也是P-gp抑制剂。韦灵玉等[10]将黄芩提取液大鼠连续灌胃一周，体外评价P-gp底物罗丹明123和非P-gp底物荧光素钠经大鼠空肠黏膜吸收方向和分泌方向的转运变化，发现黄芩提取液对P-gp活性具有抑制作用。范岚[11]研究了黄芩苷对P-gp底物他林洛尔药代动力学影响，表明黄芩苷能显著提高他林洛尔Cmax和AUC(0-12)，显示黄芩苷可以抑制P-gp活性，与本研究结果一致。 除探针药物外，利用荧光定量PCR开展药物转运体、代谢酶的mRNA表达也是研究药物-药物影响和药物代谢的重要方法。Miao Q等[12]利用Caco-2细胞比较了黄芩素和黄芩苷对的P-gp活性和表达水平的影响，发现黄芩素对P-gp活性和表达水平抑制作用明显，而黄芩苷对P-gp的表达无影响。本研究选择大鼠进行体内试验，荧光定量PCR检测诱导给药后大鼠的肝脏和肠道P-gp mRNA表达量。结果显示，黄芩苷连续诱导给药，可下调大鼠肝脏和肠道P-gp的表达，增加药物在肠道吸收，提高药物的生物利用度，这与药动学试验结果一致。大鼠体内试验结果和其他学者体外试验结果的差异，应与大鼠口服黄芩苷后，在肠道内大部分被菌群转化为黄芩素后再吸收有关[13]。

综上所述，黄芩苷通过下调药物转运蛋白P-gp的表达来提高P-gp底物在大鼠体内的吸收，提高了药物的生物利用度，然而大鼠体内存在种类众多的转运蛋白，且药物的吸收代谢还受到肝药酶的影响[14]，因此尚需对此进行进一步的研究，更加明确其作用机制，为黄芩苷在临床的应用奠定基础。

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(编辑：陈希)

Effects of Baicalin on Pharmacokinetics of Fexofenadine in Ratsinvivo

WANG Bin1,2, YANG Rui1,2,LI Si-cong1,2, ZHANG Min1,2,LI Jin-liang1,2, LI Xu-ting1,2*

(1.InstituteofVeterinaryPharmacology,SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu610066,China; 2.SichuanAnimalBreedingandGeneticsKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610066,China)

LIXu-ting,E-mail: 676049640@qq.com

To investigate the effects of baicalin on the pharmacokinetics of fexofenadine and the expression level of P-gp in rats,36 SD rats were randomly divided into A,B and C groups, rats in A group were oral administered with baicalin(200 mg/kg), B with distilled water and C with verapamil (10 mg/kg) respectively for 7 d. On the 8th d, After 2 h of administering, 6 rats in each group were killed .The liver and jejunum were collected respectively to evaluate the P-gp mRNA expression level by real-time fluorescent quantitative PCR. The other rats were administered with fexofenadine(30 mg/kg). The concentrations of fexofenadine in plasma after administration were determined by HPLC. After administered with baicalin, Cmaxand AUC(0-12)of nifedipine were significantly increased, and the level of P-gp mRNA expression in liver and jejunum were decreased. It is concluded that baicalin is an inhibitor of P-gp, which can enhance the bioavailability of nifedipine and decrease the level of P-gp mRNA expression significantly

baicalin；fexofenadine；pharmacokinetics；real time PCR；P-gp

四川省公益性科研院所基本科研业务费项目(SASA2015A16)；四川省财政运行专项(SASA2014CZYX010) 作者简介： 王斌，硕士，从事新兽药的开发与应用工作。

李旭廷。 E-mail: 676049640@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.10

2017-02-23

A

1002-1280 (2017) 07-0052-05

S859.79