超高效液相法(UPLC)用于黑果枸杞指纹图谱的研究

林 丽，石亚娜，高素芳，晋 玲,3*，王振恒,3，赵 帆

(1. 甘肃中医学院药学院，甘肃 兰州 730000；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205；3.中(藏)药资源研究所，甘肃 兰州 730000)



超高效液相法(UPLC)用于黑果枸杞指纹图谱的研究

林 丽1，石亚娜2，高素芳1，晋 玲1,3*，王振恒1,3，赵 帆1

(1. 甘肃中医学院药学院，甘肃 兰州 730000；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205；3.中(藏)药资源研究所，甘肃 兰州 730000)

【目的】 建立黑果枸杞UPLC指纹图谱分析技术，为快速鉴别黑果枸杞提供依据。【方法】采用超高效液相色谱法进行测定。【结果】以ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm )；流动相为甲醇(A)、0.5 %三氟乙酸、1 %甲酸水溶液(B)、乙腈(C)，以0.3 mL/min流速进行梯度洗脱，检测波长300 nm，进样量1.000 μl，柱温35 ℃ 为色谱条件，建立了黑果枸杞的UPLC特征指纹图谱共有模式，标定了13个共有峰，14批次黑果枸杞的相似度为 0.809～0.989，不同省份差异较大。【结论】该方法快速、高效，稳定可靠，为黑果枸杞的鉴别和质量评价及质量控制提供了科学依据。

UPLC；黑果枸杞；指纹图谱

黑果枸杞为茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)的干燥成熟果实。【研究意义】黑果枸杞味甘，性平，富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等多种营养成分[1-3]。具有良好的医疗保健功能，《四部医典》、《晶珠本草》等经典藏药著作中记载用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症[4]；《维吾尔药志》记载黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、月经不调、癣疥、齿龈出血等病症，民间用作滋补强壮、明目及降压药[5]。广泛分布于中国西北地区的宁夏、青海、甘肃、新疆和西藏，在中亚、欧洲高加索亦有分布[6-7]。【前人研究进展】近年来，为了保护黑果枸杞野生资源，开展了对其人工栽培技术的研究，并初步获得成功[8]。目前，中国部分地区已经开始栽培。随着对黑果枸杞药用价值的深入研究对产地区分有一定意义，而采用 UPLC 建立黑果枸杞指纹图谱分析方法未见报道。【本研究切入点】超高效液相色谱(UPLC)是以 1.8 μl的超细色谱柱填料为核心技术的新型色谱分离分析技术，相对于常规 HPLC 而言，UPLC 有更好的分析效果及灵敏度[9-11]。鉴于植物药具有复杂的化学成分，色谱指纹图谱方法是评价植物药质量的有效方法之一[12-13]。【拟解决的关键问题】本研究以不同产地14批次黑果枸杞药材为研究对象，采用UPLC法建立黑果枸杞的特征指纹图谱，以期为今后黑果枸杞的开发利用提供依据。

表1 黑果枸杞来源信息

1 材料与方法

1.1 材料

不同产地黑果枸杞来源(表1)，经甘肃中医药大学药学院晋玲教授鉴定为茄科枸杞属黑果枸杞Lyciumruthenicum的干燥成熟果实。

1.2 仪器

Thermo Fisher ultimate 3000 RSLC超高效液相色谱仪(包括XRS自动进样器、RS柱温箱、DAD二极阵列检测器、Chromeleon 7.2色谱工作站，XRS高压四元梯度泵)(美国赛默飞世尔科技公司)；Al104万分之一电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；OHAUS corporation DV SERIES 十万分之一电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司)；DHG-9123A电热鼓风恒温干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；KQ-250TDB型高频数控超声波清洗器(昆仑山超声仪器有限公司)； 800 型离心沉淀机(10 000 r/min)购自上海手术器十厂； DGG-9620A 电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科普仪器有限公司)。

1.3 试剂

色谱纯甲酸、三氟乙酸( TFA )购自 TEDIA 公司；色谱纯甲醇购自赛默飞世尔科技有限公司；色谱纯乙腈购自 GARDENA 公司；0.22 μm 有机系滤膜；水为屈臣氏蒸馏水，0.22 μm 水系滤膜；分析纯无水乙醇。

1.4 方法

1.4.1 供试品制备 精密称取1.000 g 黑果枸杞粉末，3份，置于具塞三角瓶中，加入 50 % 乙醇 20 mL(1∶20)，在功率400 w下，超声提取15 min，在10 000 r/min下离心10 min，取上清液待用。

1.4.2 指纹图谱条件 色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18 色谱柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；甲醇(A)，0.5 % 三氟乙酸、1 %甲酸水溶液(B)，乙腈(C)为流动相，体积流量0.3 mL/min，柱温 35 ℃，进样量 1 μl ，波长测定 300 nm。

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度试验 取同一批次供试品(批号)，在“1.4.1”项提取供试品溶液，在“1.4.2”项条件下连续进样5 次，记录色谱图，并计算共有峰相对保留时间和相对峰面积。计算结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.318 %～1.795 %(RSD≤3.00 %)，见表3；相对峰面积的RSD在 0.197 %～2.993 %(RSD≤3.00 %)，见表4，结果表明仪器的精密度良好。

表2 指纹图谱流动相线性梯度

表3 精密度试验保留时间的RSD 值

表4 精密度试验峰面积的 RSD 值

表5 重复性试验保留时间的 RSD 值

表6 重复性试验峰面积的 RSD 值

1.5.2 重复性试验 取同一批样品5份，按“1.4.1”项下提取供试品溶液，按“1.4.2”项下的方法分别进样，记录色谱图，并计算共有峰相对保留时间和相对峰面积。计算结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD在0.318 %～2.674 %(RSD≤3.00 %)，见表5；相对峰面积的RSD0.184 %～2.973 %(RSD≤3.00 %)，见表6，结果表明该方法的良好。

1.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按 “1.4.1、1.4.2”项下的方法分别在0，2，4，8，12，24 h进样测定，记录色谱图，并计算共有峰相对保留时间和相对峰面积。计算结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD0.345 %～2.54 %(RSD≤3.00 %)，见表7；相对峰面积的RSD0.361 %～2.759 % (RSD≤3.00 %)，见表8，表明样品溶液在24 h内稳定。

表7 稳定性试验保留时间的 RSD 值

表8 稳定性试验峰面积的 RSD 值

2 结果与分析

2.1 供试品测定

在上述同一条件下，连续测定14批次黑果枸杞供试品的 UPLC 指纹图谱。

2.2 指纹图谱

根据以上 14 批供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分数)和峰位(相对保留时间)等相关参数，除去前 1 min 的溶剂峰，进行分析、比较、制定优化的指纹图谱见图1 。

图1 黑果枸杞UPLC特征图谱(300 nm)Fig.1 UPLC fingerprint chromatogram of Lycium ruthenicum(300 nm)

2.3 指纹图谱建立与相似度评价

将所得的 14 批次黑果枸杞 UPLC 图谱依次导入国家药典委员会研制的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2004版A)，以 S1 批药材谱图作为参照谱进行指纹匹配，确定了13 个共有峰，建立了黑果枸杞特征指纹图谱的共有模式，并进行了相似度计算，14 批次药材的叠加指纹图谱，见图2，13 个指纹峰相对保留时间如表9所示，共有指纹峰相对峰面积如表10所示，黑果枸杞与对照指纹图谱的相似度见表11。

图2 14批黑果枸杞UPLC指纹图谱叠加图(300 nm)Fig.2 UPLC fingerprints for 14 batches of Lycium ruthenicum(300 nm)

编号No.共有峰相对保留时间(min)Retentiontimeofgeneralpeaks12345678910111213S11.6191.9853.5854.1234.3104.7144.7345.1455.4035.6786.1316.5286.913S21.6301.9113.5914.1544.4094.6544.7365.2985.4395.5926.0676.5786.923S31.6292.0063.5674.0094.3814.7014.7235.2555.5085.6555.9826.4896.874S41.6341.9833.6004.1904.3984.6934.7525.1605.4795.6396.0106.4576.976S51.6111.9873.5784.1984.3764.7214.7475.2105.5115.6476.0216.5096.896S61.6451.9143.6124.1074.4114.6784.7055.1965.4575.6486.1136.5526.881S71.6521.9583.3854.2634.3104.6224.7145.1475.4115.6976.1366.5196.929S81.6231.9633.4904.0734.3334.5304.7215.2075.4105.6206.0516.5126.947S91.6092.0343.5714.1554.3624.6634.7455.1755.4945.6766.1456.5766.855S101.6411.9513.5874.1364.4254.6474.6995.1505.4255.6546.1716.4946.921S111.6311.9653.6134.1954.3944.6954.7555.1635.4775.6366.1016.4776.955S121.6141.9733.5744.1924.3774.7224.7495.2155.5135.6416.1146.5166.893S131.6231.9163.6224.1094.4124.6734.7155.1945.4565.6446.1036.5346.887S141.6431.9783.3894.2674.3184.6274.7195.1435.4175.6916.1276.5376.931RSD(%)0.8121.7862.1841.6900.9151.0940.3870.8750.7380.4930.9220.5340.490

表10 黑果枸杞UPLC指纹图谱共有峰峰面积

表11 不同产地黑果枸杞相似度比较

由表9、10可知，各产地黑果枸杞中共有峰的保留时间非常相近，RSD在 0.387 %～2.184 %，这也再次证实了各共有峰选择的准确性，但是峰面积相差较大，则说明共有峰所代表成分含量差别较大。由表11可看出，除S9、S10、S11、S12、S13、S14这6 批次样品的相似度较低(<0.900)外，其他产地的黑果枸杞相似度较好。

3 讨 论

3.1 供试品溶液制备条件的考察

试验比较了不同提取溶剂如甲醇、乙醇的超声提取、浸提等不同提取方法的提取效果，结果以乙醇超声提取的总体效果为佳。同时还考察了以乙醇为提取溶剂不同浓度、提取时间和功率的提取效果。结果表明以50 %乙醇为提取溶剂，功率400 w下，超声提取15 min，提取较完全，操作方法简便，且方法稳定，重现性好。采用乙醇超声提取样品，图谱信息量较大，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反应了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。

3.2 色谱条件的选择及优化

在流动相系统的选择中，分别以乙腈-水，乙腈-1 %甲酸水，甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸水，甲醇-0.5 % 三氟乙酸等不同体积分数、不同比例的流动相进行了等度和梯度洗脱实验。结果表明用甲醇-0.1 %磷酸水，甲醇-0.5 %三氟乙酸洗脱更佳，色谱峰检测比较全面，分离度好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线平稳，不宜漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。

3.3 检测波长的选择

对270、280、300、320和530 nm 5个波长进样扫描，色谱图进行比较分析，结果300 nm处检测的色谱图基线平稳、信息量多、各色谱分离效果好、峰面积大，因此，选 300 nm 作为检测波长。

3.4 分析时间的选择

在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了20 min的色谱行为图。结果表明8 min以后基本没有色谱峰的出现，同时为了照顾样品的产地、采收时间等的差异性，保证所有样品的特征峰都能被检出，因此选择 10 min 作为分析时间。

4 结 论

本论文中所研究的黑果枸杞UPLC指纹图谱具有较好的稳定性和重复性，14批样品指纹图谱特征性和专属性很强，其主要峰群的整体图貌基本一致，13 个共有峰稳定性很好。相似度评价分析得 14 批次黑果枸杞药材的相似度，8 个甘肃不同产地的黑果枸杞的相似度均在 0.900以上，表现出较高的相似度，青海的4 个样品相似度较低(0.867～0.875)，新疆的2 个样品相似度最低 (0.809～0.811)。综上可得出相同条件不同省份的黑果枸杞相似度较低，具有明显差异，故可用此方法快速、简便的鉴别不同产地的黑果枸杞。

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(责任编辑 王家银)

Analysis of Ultra Performance Liquid (UPLC)for Black Fruit Wolfberry Fingerprints

LIN Li1, SHI Ya-na2, GAO Su-fang1, JIN Ling1,3*, WANG Zhen-heng1,3, ZHAO Fan1

(1.Gansu University of Chinese Medicine, Gansu Lanzhou 730000, China; 2.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China; 3.(Tibet) Traditional Medicine Resources Institute, Gansu Lanzhou 730000, China)

【Objective】The purpose of this paper is to provide a rapid identification method forLyciumruthenicumMurr based on the establishment of UPLC fingerprint. 【Method】Experiments were performed by UPLC method. 【Result】 Using ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm), methanol(A), 0.5 % trichloroacetic, 1 % formic acid(B) and acetonitrile(C) as the mobile phase, the detection wavelength 300 nm, column temperature 35 ℃, the flow rate 0.3 mL/min, the injection volume 1.000 μl, the mutual mode of UPLC fingerprint ofLyciumruthenicumMurr was established. There were 13 common peaks in the fingerprint of 14 samples. The similarity of the 14 samples was ranged from 0.809 to 0.989 and it indicated that the UPLC fingerprints of the samples from different provinces were obviously different. 【Conclusion】The UPLC method has good precision, stability and repeatability. The fingerprint established in this study can supply scientific method for the identification, quality evaluation and control ofLyciumruthenicumMurr.

UPLC;LyciumruthenicumMurr; Fingerprint

1001-4829(2017)6-1426-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.032

2016-06-16

国家中医药管理局中医药行业专项“甘肃省代表性区域中药资源保护利用”(2012070025-02)；甘肃省中医药管理局项目“黑河流域黑果枸杞的资源调查及质量评价”GZK-2012-21；甘肃省科技计划基础研究创新群体“甘肃省中藏药资源评价、保护与开发利用”(1606RJIA323)；中央财政引导地方科技创新平台项目“甘肃省中药资源与新产品开发平台建设”(2016-A-02)

林 丽(1965-)，女，高级工程师，学士，研究方向为中药鉴定及中药资源可持续利用，E-mail:xrhlin@sina.com，*为通讯作者：晋 玲，(0931)8722303，E-mail :zyxyj@163.com。

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