Bax、Bcl-2和Caspase-3在食管癌的表达及临床意义

马永臻

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)



Bax、Bcl-2和Caspase-3在食管癌的表达及临床意义

马永臻

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)

目的 研究凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3在食管癌的表达变化，分析其与食管癌发生的相关性。方法 TUNEL染色检测食管癌细胞凋亡情况，免疫组化方法检测Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白在食管癌表达的变化，分析其与食管癌临床病理特征之间的关系，分析其与食管癌发展与预后的相关性。结果 食管癌组织的凋亡指数明显低于正常组织和癌旁组织的凋亡指数(P<0.01)。Bcl-2蛋白在癌组织的表达明显高于正常组织和癌旁组织(P<0.01)，而Bax和Caspase-3蛋白在癌组织的表达明显低于正常组织和癌旁组织(P<0.01)。Bcl-2和Bax蛋白的表达与食管癌的分化程度以及淋巴转移有关(P<0.05)；Caspase-3蛋白的表达与外膜浸润和淋巴转移密切相关(P<0.05)。结论 Bax、Bcl-2和Caspase-3与食管癌的发生密切相关，可作为食管癌发展和预后判断的指标。

食管癌；细胞凋亡；Bax；Bcl-2；Caspase-3

从分子水平探讨食管癌的发生和发展机制成为食管癌研究的热点之一，食管癌的早期诊断和治疗是降低死亡率的关键〔1〕。肿瘤的发生、发展与细胞凋亡有着密切关系，目前对于食管癌发生机制的研究较多，但对凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3的研究尚未见报道。本研究应用免疫组织化学方法检测食管癌组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达，分析其与食管癌临床病理特征之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月至2014年8月在山东医科高等专科学校附属医院行食管癌手术的患者标本47例，男32例，女15例，年龄42～78(平均64)岁。每例标本均从三个部位取材，取材标准：①正常食管组织：选取距癌灶6 cm以上的食管黏膜；②癌旁组织：选取距癌灶3 cm以内的不典型增生黏膜组织；③癌组织：选取癌灶内无坏死组织。所有标本均经病理学确诊，癌组织均为鳞癌，高分化14例，中分化22例，低分化11例。病例临床资料完整，术前均未进行化疗和放疗。所有标本常规石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.2 试剂 兔抗人Bax、Bcl-2和Caspase-3单克隆抗体和阳性对照片由美国Santa Cruz公司提供，FITC标记的羊抗兔IgG、山羊封闭血清、二氨基联苯胺(DAB)显色剂和PBS购自北京中杉金桥生物科技有限公司。原位凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购自武汉博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 苏木素-伊红(HE)染色 组织切片均行常规HE染色，以进行病理分型，证实癌旁组织和正常组织中无癌细胞。

1.3.2 TUNEL染色 随机选择10例标本的不同部位的组织切片进行TUNEL染色。切片脱蜡入水，滴加新鲜配制的3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，蛋白酶K消化，滴加标记反应液，封闭液，滴加生物素化地高辛抗体，DAB显色。脱水，透明，封片。观察各组织细胞凋亡情况，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每片在上、下、左、右、中部位随机观察500个细胞，计算细胞凋亡指数，取平均值。重复计数3次。凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3.3 免疫组化染色 石蜡切片60℃温箱烤片过夜，梯度酒精脱蜡至水；3%H2O2封闭；0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液煮沸修复抗原；5%BSA封闭液37℃封闭20 min；分别滴加Bcl-2、Bax和Caspase-3单抗(工作液1∶200稀释)；PBS代替一抗作阴性对照，公司提供的阳性对照片为阳性对照。4℃冰箱孵育过夜；滴加二抗，DAB显色，脱水，透明，封片。显微镜下观察，分别比较Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白阳性着色的位置和强度。

1.3.4 阳性染色判断标准 细胞质内呈现棕黄色颗粒者为阳性细胞。每一张切片在高倍镜下随机选择10个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分数，以阳性细胞>10%为阳性表达；≤10%为阴性表达。

1.3.5 图像分析 用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统测量Bax、Bcl-2和Caspase-3阳性表达细胞的吸光度(A)值。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行t及χ2检验及方差分析。

2 结 果

2.1 细胞凋亡结果 TUNEL染色结果可见，食管癌组织的凋亡指数〔(4.26±1.03)〕明显低于正常组织〔(8.95±1.86)，P<0.01〕，而癌旁组织的凋亡指数〔(8.06.95±1.69)〕与正常组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 免疫组化染色切片观察 Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白定位于细胞质和细胞膜，在食管正常组织、癌旁组织和癌组织都有表达。Bcl-2蛋白在癌组织的表达明显高于正常组织和癌旁组织(P<0.01)，而Bax和Caspase-3蛋白在癌组织的表达明显低于正常组织和癌旁组织(P<0.01)，三种蛋白在正常组织和癌旁组织的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 凋亡相关蛋白阳性率与食管鳞癌临床病理特征的关系 Bcl-2蛋白的表达与食管癌的分化程度和淋巴转移有关系，中、低分化鳞癌Bcl-2蛋白的表达明显高于高分化鳞癌(P<0.05)，有淋巴转移的鳞癌Bcl-2蛋白的表达明显高于无淋巴转移者(P<0.05)。Bax蛋白在中分化鳞癌的表达明显高于高、低分化鳞癌(P<0.05)，有淋巴转移的鳞癌Bax阳性率明显低于无淋巴转移者(P<0.05)。Bcl-2和Bax蛋白的表达均与患者的年龄、性别、外膜浸润及临床分期无关(P>0.05)。Caspase-3蛋白的表达与有无外膜浸润和有无淋巴转移密切相关(P<0.05)，与其他指标无关(P>0.05)。见表2。

表1 食管不同部位组织凋亡相关蛋白表达的平均灰度值

表2 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨 论

恶性肿瘤的病因目前尚未完全了解，一般认为肿瘤是环境因素与自身因素相互作用的结果，引起细胞癌变的因素很多，比如细胞过度增生、细胞周期功能紊乱、逃逸凋亡及血管增生等〔2〕。细胞凋亡是机体在内、外环境刺激下启动的由基因调控的细胞死亡过程，调控细胞凋亡的基因有多种，Bcl家族就是调控细胞凋亡的基因之一〔3〕。

Bcl-2与Bax分别以同源二聚体形式存在，Bax蛋白自身可形成同二聚体，也可与Bcl-2组成异二聚体，Bax基因的表达产物可以促进细胞凋亡的发生，Bcl-2基因的表达产物可以通过多种途径阻止细胞凋亡的发生，包括拮抗Bax的促凋亡作用〔4〕。当细胞内Bcl-2表达增加时，Bcl-2与Bax形成的异二聚体增加,可以抑制Bax同二聚体的形成，从而阻止Bax蛋白的促凋亡作用〔5,6〕。本实验说明食管癌细胞的促凋亡作用减弱，同时抑制细胞凋亡的作用增强，这两个因素叠加在一起，导致细胞凋亡过少，造成了癌细胞的过度增生，从而发展成肿瘤。当然，Bcl-2和Bax蛋白如果单方面发挥作用，可能也会导致肿瘤的发生，这有待于进一步的实验研究。食管癌组织中Bcl-2蛋白高表达提示食管癌组织分化程度差，恶性程度高。这一结果与宋晓环等〔7〕的研究结果一致。

Caspase为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，与真核细胞凋亡密切相关，还参与细胞因子的成熟、细胞生长和分化等过程。凋亡信号的转导包括死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径三种途径，它们均以Caspase激活开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为最终结局。通常状态下，它们是以无活性的酶原形式存在的，当受到凋亡信号刺激时，上游的Caspase能次序激活下游的Caspase，形成级联反应，将凋亡信号逐级传至凋亡产物〔8〕，其中Caspase-3是这个家族中最重要的凋亡执行者，它的激活可直接导致细胞凋亡〔9〕。目前认为，Bcl-2抑制细胞凋亡的机制可能与凋亡促进基因Bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放到胞质，阻止细胞色素C对Caspase蛋白酶激活有关〔10,11〕。本实验说明Caspase-3的低表达抑制了细胞凋亡，使癌细胞无限制地增生，最终导致了食管癌的发生。这一结果与周正斌等〔12〕和郭艳丽等〔13〕的研究结果一致。

本实验还发现，Bcl-2蛋白的表达与食管癌的分化程度和淋巴转移有关系，这样的结果与Bcl-2和Bax基因对细胞凋亡的调节作用是一致的。胡玉英等〔14〕的研究结果提示：补肾止颤方联合埋针疗法能明显抑制Bax蛋自表达及促进Bcl-2蛋自表达，使神经细胞凋亡明显减少,与本研究有一致之处。Bcl-2和Bax蛋白的表达均与患者的年龄、性别、外膜浸润及临床分期无关。Caspase-3蛋白的表达与有无外膜浸润和有无淋巴转移密切相关，与其他指标无关。李军华等〔15〕的研究也证实Bcl-2与食管癌的淋巴转移和分化程度密切相关，与本研究一致。

综上所述，本研究结果提示Bcl-2、Bax和Caspase-3或许可以作为食管癌早期诊断和预后判断的指标，并提供靶向治疗的新途径。

1 王 欢,向明飞，刘 罡，等.94853例恶性肿瘤住院患者疾病构成及死因分析〔J〕.东南大学学报(医学版),2014;33(2):187-91.

2 Culmsee C，Plesnila N.Targeting Bid to prevent programmed cell death in neurons〔J〕.Biochem Soc Trans,2006;34(6):1334-40.

3 Park JS,Park JH,Lee S,etal.Small interfering RNA targeting of recepteur d'Origine Nantais induces apoptosis via modulation of nuclear factorkappaB and Bcl-2 family in gastric cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2010;24(3):709-14.

4 Jeong SH,Han JH,Kim JH,etal.Bax predicts outcome in gastric cancer patients treated with 5-fluorouracil,leucovorin,and oxaliplatin palliative chemotherapy〔J〕.Dig Dis Sci,2011;56(1):131-8.

5 Vandenabeele P,Grootjans S,Callewaert N，etal.Necrostatin-1 blocks both RIPK1 and IDO:consequences for the study of cell death in experimental disease models〔J〕.Cell Death Differ,2013;20(2):185-7.

6 Galluzzi L,Senovilla L,Vitale I,etal.Molecular mechanisms of cisplatin resistance〔J〕.Oncogene,2012;31(15):1869-83.

7 宋晓环,孙冬梅,王忠超,等.凋亡抑制基因环氧化酶-2及Bcl-2在甲状腺癌组织中的表达〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(7):1933-5.

8 陈益华,张华杰,南发俊.Caspase 抑制剂的研究进展〔J〕.生命科学，2006;18(3):248-53.

9 Sikdar S,Mukherjee A,Ghosh S,etal.Condurango glycoside-rich components stimulate DNA damage-induced cell cycle arrest and ROS-mediated caspase-3 dependent apoptosis through inhibition of cell-proliferation in lung cancer,in vitro and in vivo〔J〕.Environ Toxicol Pharmacol,2014:37(1):300-14.

10 Takeno S,Yamashita S,Takahashi Y,etal.Survivin expression in esophageal squamous cell carcinoma:its prognostic impact and splice variant expression〔J〕.Eur J Cardiothorac Surg,2010;37(2):440-5.

11 Schuchert MJ,Luketich JD,Landreneau RJ.Management of esophageal cancer〔J〕.Curr Probl Surg,2010;47(11):845-6.

12 周正斌,周 瑞,黄 震,等.生存素和Caspase-3蛋白在食管癌前病变及癌组织中的表达及意义〔J〕.江苏大学学报(医学版),2014;24(4):342-5.

13 郭艳丽,李颖霞,陈奎生,等.食管鳞状细胞癌组织中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达〔J〕.郑州大学学报(医学版),2014;49(4):452-6.

14 胡玉英,陈 薇.补肾止颤方联合埋针疗法对帕金森病模型大鼠Bcl-2及Bax表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2015；35(5):1341-3.

15 李军华,王 认,刘彦恒.Survivin和Bcl-2在食管鳞癌中的表达及临床意义〔J〕.内蒙古医学杂志,2013;45(1):20-2.

〔2016-03-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省医药卫生科技发展计划(No.2011HZ098)

马永臻(1970-)，女，教授，硕士，主要从事肿瘤病理研究。

R735.1

A

1005-9202(2017)14-3484-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.046