小檗碱抑菌作用的研究：调控肠道菌代谢的可能性及其意义＊

李慧玉，袁梽漪，王玉刚，雷帆，邢东明，谢伟东，李俊，杜力军＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室北京100084；2.重庆医科大学药学院重庆400016；3.清华大学药学院北京100084；4.清华大学深圳研究生院生命与健康学部深圳518005；5.江西中医药大学创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室南昌330006）

小檗碱抑菌作用的研究：调控肠道菌代谢的可能性及其意义＊

李慧玉1，袁梽漪2，王玉刚1，雷帆3，邢东明1，谢伟东4，李俊5，杜力军1＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室北京100084；2.重庆医科大学药学院重庆400016；3.清华大学药学院北京100084；4.清华大学深圳研究生院生命与健康学部深圳518005；5.江西中医药大学创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室南昌330006）

小檗碱（BBR）作为抗肠道感染的经典药已为人们所熟知，其抑制肠道菌的作用是其治疗肠道感染作用的核心。随着对肠道菌在肠道的生存变化及其相关代谢产物对全身生理病理功能所产生影响的不断认知，越来越多的文献显示BBR可能通过影响肠道菌从而对体内糖脂代谢以及脑功能活动产生影响。本文在此背景下对BBR抑菌作用的研究进行分析综述，并依据原核生物基因表达的特点对BBR可能作用的分子靶点进行分析，以期有助于对BBR调控肠道菌机制的深入研究，从而更全面的认识BBR的药理作用。

小檗碱肠道微生物基因转录

小檗碱（Berberine，BBR）具有广谱的抑菌作用，对多种耐药菌有抑制作用[1]，还具有抗腹泻、抗肿瘤、抗脑缺血、调节糖脂代谢、抗炎、调节体温等作用[2-6]。目前所表现出来的BBR的诸如降血糖调血脂等新的作用均需要长期口服给药。如此，BBR对肠道菌的抑制作用对于全身的生理功能调节势必产生影响。对于肠道菌及其代谢产物对全身生理病理功能的调控作用己越来越为人们所重视，而BBR的对肠道菌的抑制作用也由简单的抗菌抗感染扩展到对其他诸如内分泌代谢、脑功能及其神经退行性疾病的影响。因此，深入分析认知BBR的这种对肠道菌的抑制作用，具有重要的理论和临床意义。

1 BBR的理化特性

BBR为黄色结晶，熔点为145℃，分子量[C20H18NO4]+为 336.37（PubChem CID:2535.https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/compound/2353#section=Top）。BBR结构中的氮原子位于分子结构的中心，带正电氮原子是其主要活性部位，以此为基本结构的BBR类似物其活性除了有强弱之分外基本一致[7]。BBR的带正电的分子结构提示其易与带负电的分子或离子结合，推测可能是形成其基本活性的位点[8]。

2 BBR的抑菌作用

2.1 抑菌

到目前为止，BBR抑菌作用尚未完全阐明。已有研究表明，BBR抑菌作用与其影响细菌的细胞壁、影响细菌代谢等有关。BBR的抑菌作用与其促使细胞壁钙离子通透性增强有关，BBR可以引起细胞内钙流失，由此增加细菌细胞的通透性，影响细菌的生长[9]。此外，BBR能够与细菌体内的磷酸吡哆醛竞争酪氨酸脱羧酶、色氨酸酶进而产生抑菌作用；可以抑制细菌糖代谢及其主要的产物丙酮酸的氧化，同时影响细菌对维生素B6和烟酰胺的利用，使细菌生长受到抑制[10]；通过抑制细菌体内一些基本物质的合成，影响细菌增殖[11]。此外，BBR可以直接与细胞分裂蛋白FtsZ相互作用，干扰FtsZ的组装，抑制细菌的细胞分裂[12,13]。以上结果都是从蛋白表达的角度来认识BBR的抑菌作用。由于BBR口服后不易被吸收，从而在胃肠道可以保持较高的药物浓度，为抑制肠道菌提供了必要的条件[14]。

2.2 BBR抑菌的构效关系

化学类抗菌药喹诺酮类药物通过作用于细胞的DNA回旋酶、拓扑异构酶和细胞壁多糖肽等产生抑菌作用[15]。通过相关软件进行分子拟合发现BBR与喹诺酮类药物的立体结构具有高度相似性[16]，提示BBR可能存在与喹诺酮类药物类似的抑菌机制。通过合成一系列的原BBR类化合物并进行的相关筛选实验结果显示，BBR芳环碳原子上的季铵结构以及2、3位的二甲氧基，8、13位烷基链长度，9位上的烷氧基链长度对BBR的抗菌活性都有一定的影响[17-19]。

2.3 小分子与DNA的相互作用

药物分子与核酸结合的部分包括有核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。核酸的碱基、聚合的磷酸骨架以及由两条核苷酸链形成的大、小沟都可能成为药物识别的位点。一般来说，药物小分子与核酸结合的方式可能有非共价、共价结合和剪切作用等三种形式[20,21]。

非共价结合。非共价结合主要有以下三种模式[22]：（1）以静电形式结合（Electrostatic binding）：一般认为由于电倾向性而在表面进行接合的药物分子作用于DNA双螺旋结构的表面；（2）以沟槽形式结合（Groove binding）：指药物分子与DNA双链形成的大沟或小沟的碱基对外向边缘作用；（3）以插入形式结合（Interca⁃lative binding）：指药物分子直接插入到DNA双螺旋沟中，并且与DNA碱基发生作用。药物分子与DNA相互作用的方式与它们之间的分子结构与构象、电子云分布密切相关[23]。此外，小分子与DNA结合还有疏水作用、氢键作用和范德华力等弱结合形式。

共价结合。一般而言，亲核和亲电小分子倾向于与DNA共价结合[24]。

剪切作用。剪切作用指药物分子可以特异性地与DNA结合位点进行结合，且能够使DNA断裂的一种作用[25-27]。通过多种光谱实验方法证实，BBR可以通过插入方式与DNA双链结合，但是其是否具有剪切作用尚不清楚，需要更多的实验证实[28]。

2.4 BBR与DNA键合模型的探讨

BBR的荧光发射光谱主要来自其分子结构中异喹啉部分的两个带，分别标记为1La和1Lb带[29]。1Lb发射带的强度随着DNA加入的浓度增高而显著增强。在疏水环境中BBR的发射光谱中1Lb带的荧光强度明显增强，同时1La带的发射强度也有一定程度的增加。推测BBR可能是通过其异喹啉结构插入到DNA双螺旋的小沟沟槽中与DNA发生相互作用。理论上BBR结构中的N原子所带的正电荷与DNA磷酸基团的负电荷存在一定的静电相互作用，但是从我们所观察的BBR与单链dAMP的核磁共振二维谱结果来看，BBR与DNA磷酸基团并无明显作用[30]。提示DNA双链形成的互补碱基是其与BBR的直接相互作用的主要影响因素，尤其与AT互补碱基结合时所缺少的一个氢键是BBR含正电结构的插入位点，这也是为什么BBR与AT互补碱基链亲和力强于GC互补碱基链的主要原因[31]。

此外，DNA对BBR的荧光有一定的加强作用。BBR能够产生较弱的荧光，但是当其与DNA结合后，其荧光强度大大增加，并且BBR和DNA之间互相作用后的发光具有浓度依赖性[32]。提示BBR是由DNA控制的发光开关，在有DNA存在时发光增强，无DNA时荧光变弱，显示了较好的荧光增强性能。

3 原核生物启动子序列特征及RNA聚合酶

启动子（Promoter）是指一段存在于基因转录起始区特定的DNA序列。它可以通过与RNA聚合酶结合并在相关蛋白因子的复合作用下起动该基因的转录[33]。原核生物类启动子大多是RNA聚合酶可以直接识别的DNA序列，其结构较为简单。细菌的启动子大多属于此类[34,35]。真核生物的启动子较为复杂，多是需要多种蛋白质作为辅助因子，与RNA聚合酶共同完成基因的转录启动。己知BBR对哺乳类基因的启动子TATA-box具有特异性作用，并为其作用的重要靶点之一[31,36]。如此，原核类病原菌生物启动子应该也是BBR潜在作用靶点。

原核生物RNA聚合酶由5个蛋白亚基组成，其中α亚基主要与启动子的UP元件结合，增强基因转录起始[37]，而б亚基决定着特异性识别DNA序列。大肠杆菌的RNA聚合酶含有7种б亚基，其中б70参与了绝大多数基因的起动转录。原核生物的RNA聚合酶与启动子转录区基因序列结合的α亚基主要结合于转录区的UP元件（UP element），该元件富含TA碱基。б亚基原则主要结合于转录起始位点（TSS，transcription start site）的-10区序列和-35区序列。-10区序列含有典型的TATA序列，而-35区序列也含有TA碱基。己知BBR主要对TA碱基结合有偏好性，因此这些序列可能是BBR抑制基因转录的主要作用靶点。大肠杆菌启动子的保守序列有：“-10区序列”、“-35区序列”以及“-10到-35区间序列”[38]。几乎大肠杆菌所有的启动子都存在有一个含6个碱基（bp）的保守区域，因其中心通常靠近-10 bp处，而称为-10区序列。其序列构成TATAAT，其详细形式为：T80A95T45A60A60T96（下标数字表示碱基出现频率的百分数）。故-10区序列中最开始的高度保守的TA和最后一个几乎完全保守的T是最重要的碱基。另一个比较保守的6 bp区域位于-35 bp处，称为“-35区序列”，大多具有TTGACA（T82T84G78A65C54A45）的相同序列。另外，在-10和-35区的间隔序列直接影响了RNA聚合酶的空间结合几何拟合度。一般来说，大多数的大肠杆菌启动子-10到-35区之间序列为16-18 bp。其距离的大小对适应RNA聚合酶的几何构象有一定影响，这种几何构象对BBR与这些序列结合、进而阻滞RNA聚合酶结合并抑制基因转录的启动将产生何种影响尚不清楚，有待于进一步研究[39,40]。总之了解上述原核生物的基因转录启动子区的分子特征，将有助于深入认识和探讨BBR的抑菌作用的分子机制。原核生物启动子区相关元件及序列特征综合示意图参见图1。

4 BBR对肠道菌群作用的临床意义

近年来肠道菌对机体生理功能的影响逐渐为人们所重视，并得到一定的揭示[41]。长期以来BBR作为抗胃肠感染药而被用于治疗肠道疾病，又BBR口服吸收较差，因此BBR对肠道菌的影响进而由此对全身生理及其病理生理功能的影响具有重要的研究价值。现有研究结果表明，其对肠道菌的影响不仅仅局限于肠道感染性疾病，还有可能通过肠道菌的抑制还影响全身。尤其是对于那些与饮食有关的代谢紊乱性疾病，例如高血糖高血脂症，进而影响肥胖[42-46]。

研究发现肠道菌可以影响机体的营养及其生长发育[47，48]，还可以影响大脑功能，影响一些神经递质，尤其是神经肽类递质的生成和释放，进而影响到脑功能[49,50]，因此也有人提出微生物-肠-脑轴（microbiotagut-brain axis）的模式[51]。鉴于BBR对肠道菌的抑制作用、并由此而对其调控脑功能的作用是未来研究的重要方向[52]。肠道菌对机体功能的影响一方面通过影响一些代谢产物，并通过这些代谢产物的吸收进入体内，而对机体功能产生影响；另一方面，肠道菌及其代谢产物本身直接作用于肠粘膜相关受体，由此进行信号递呈传导，进而影响全身功能。BBR对肠道菌的调控作用可以从这两个方面影响全身功能，BBR也可以直接作用于肠粘膜相应受体而产生直接的调控作用。

所有这些都是建立在BBR长期口服给药的前提下的。对于急性给药，例如一些急性肠道感染，这些作用的可能性影响较小。而对于目前所提及的针对糖尿病，高血脂症，以及未来重点关注的抗神经退行性疾病等，都需要长期给药。因此，探讨BBR对肠道菌的影响进而是否对全身功能进行调控，以及调控的机制等，有着重要的临床意义[53]。

图1 RNA聚合酶α亚基和б亚基与原核生物启动子保守序列相互作用模式示意图。“+1”表示基因转录起始位点

5 小结

综上，BBR对肠道菌的抑制作用不仅仅是着眼于治疗肠道感染，更应该置于通过影响肠道菌生长及其代谢产物、进而影响整体生理病理功能角度考虑。尽管己有一些相关文章发表，但由于肠道菌环境的复杂性，BBR抑菌作用的病理生理意义有待于更多的工作研究，尤其是对于那些需要长期服药的疾病。由于原核生物中的相关基因启动子区也存在TATA序列，BBR的这种在真核生物中结合TATA序列进而影响相关基因转录表达的作用特性值得借鉴和考虑。由于BBR口服生物利用度较低，且主要集中在肠道，因此BBR对肠道微生物影响的人体的生长发育、代谢、衰老等生理学病理学意义还需更深入全面的研究，此具有挑战性。

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Berberine Effect ofAnti-microbiota--Possibility and Clinical Significance on Gut Microbiota and Metabolism:AReview

Li Huiyu1,Yuan Zhiyi2,Wang Yugang1,Lei Fan3,Xing Dongming1,Xie Weidong4,Li Jun5,Du Lijun1
(1.Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences,School of Life Sciences,Tsinghua University, Beijing 100084,China;2.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China;4.Division of Life Science&Health,Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen 518005,China;5.State Key Laboratory of Innovative Drugs and Efficient Energy-saving Pharmaceutical Equipment,Jiangxi University of Chinese Medicine,Nancang 330006,China)

Berberine(BBR)is known as a classic drug for intestinal infection treatment.BBR inhibits intestinal bacteria,which is the core of its role in the treatment of intestinal infection.With the survival of local intestinal bacteria and its related metabolites on the physiological and pathological functions of the body continue to recognize the impact of it, more and more literatures have presented the effect of BBR through the impact of intestinal bacteria on the body glycollipid metabolism,even brain function.This allows us to re-understand the pathophysiology of BBR in inhibiting gut microbiome.In this paper,the antibacterial activity of BBR was reviewed and analyzed.The possible molecular target of BBR was analyzed according to the characteristics of prokaryotes gene expression,which was helpful to the in-depth study of BBR on intestinal bacteria.Thus,a more comprehensive understanding of the pharmacological effects of BBR is given.

Berberine,gut,microbiota,gene transcription

10.11842/wst.2017.04.009

R285

A

（责任编辑：郭嫦娥，责任译审：王晶）

2017-02-27

修回日期：2017-04-02

＊国家自然科学基金委重大研究计划培育项目（项目编号90713043）：基于BBR神经元保护作用探讨其PI3-K/AKT作用的始动位点及其信号转导，负责人：杜力军；国家自然科学基金委面上项目（项目编号：81374006）：基于BBR作为DNA插入子探讨其对正常与缺血再灌神经元基因转录作用差异的机制，负责人：邢东明。

＊＊通讯作者：杜力军，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：药理学。