小檗碱对大肠杆菌基因转录抑制作用的实验研究＊

李慧玉，王玉刚，袁梽漪，雷帆，王欣佩，卢希，邢东明，李俊，杜力军＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室北京100084；2.重庆医科大学药学院重庆400016；3.清华大学药学院北京100084；4.江西中医药大学创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室南昌330006）

小檗碱对大肠杆菌基因转录抑制作用的实验研究＊

李慧玉1，王玉刚1，袁梽漪2，雷帆3，王欣佩1，卢希1，邢东明1，李俊4，杜力军1＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室北京100084；2.重庆医科大学药学院重庆400016；3.清华大学药学院北京100084；4.江西中医药大学创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室南昌330006）

目的：对小劈碱（BBR）对大肠杆菌的抑制作用的分子靶点进行探讨。方法：鉴于BBR对DNA结合的偏好性，本文从基因转录表达水平对BBR的大肠杆菌生长抑制作用靶点进行实验研究。结果：BBR对于大肠杆菌基因上游调控元件UP element具有较强的亲和力，而在此元件地转录起始区含有TATA碱基序列。进一步对启动子上游含有UP element调控元件的基因sulA、recA、16S和启动子上游不含UP element调控元件的基因lpxC、secG、mutT的mRNA表达比较表明，BBR抑制sulA、recA、16S的表达，对lpxC、secG、mutT无明显作用，提示TATA序列是BBR的作用靶点。结论：本结果对从基因转录水平探讨BBR抑菌作用提供了新思路。

小檗碱大肠杆菌基因转录TATA box

小檗碱（Bererine，BBR）具有广谱抑制病原微生物作用，临床上常用于治疗细菌性腹泻。许多研究对其抑菌作用的靶点主要集中在蛋白质或代谢水平上，例如：BBR抑制细胞分裂蛋白FtsZ的组装而阻碍细胞分裂[1，2]；或是抑制细菌体内糖代谢过程中的丙酮酸氧化，使细菌对维生素B6和烟酰胺等的利用受到限制而产生抑菌作用[3]。由于BBR是一种DNA配体，在体外可与单链/双链的DNA结合[4-7]，可以通过与细菌体内DNA结合从而影响其复制而发挥抑菌作用。BBR能够利用其平面空间结构特征，“TA”碱基偏好性地插入到DNA双螺旋的小沟中[8]，利用X衍射技术证实了BBR能与DNA结合[9]。因此，推测BBR的抑菌活性可能是由于它与富含A/T碱基的双螺旋DNA小沟的特异性结合所致[10]。实验室早期的研究证实BBR可以进入真核细胞的细胞核内，并同TATA box结合蛋白TBP竞争，与mRNA启动子上游调控元件TATA box结合，干扰基因转录起始，从而抑制TATA box依赖的基因的转录[11]。综上提示，在抑菌作用中BBR的这种与DNA结合的特性可能是其发挥抑菌作用的内在分子机制。为证实这一假设，我们进行了如下实验研究。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试药

细菌培养摇床（太仓科技器材厂华利达试验设备公司）；GeneQuant 100紫外分光光度计（美国GeneralElectric公司）；YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；MDF-382E低温冰箱（日本SANYO公司）；超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）。Tprofessional Gradient PCR仪（德国Biometra公司）；5417R型台式低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂）；FR-200A型全自动紫外与可见分析装置（上海复日科技有限公司）；垂直电泳仪（美国BIO-RAD公司）；半干转转膜仪（北京六一仪器厂）。680型酶标仪（美国BIORAD公司）；Light Cycle П Real-Time PCR仪（瑞士Roche公司）。

盐酸小檗碱（纯度99%，中国食品药品检定研究院）；氨苄青霉素（Ampicillin，上海生工生物工程股份有限公司），配制为0.1 g·mL-1的母液保存；琼脂培养板：用营养琼脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）配制成浓度为2%的溶液，高压灭菌后倒入灭菌的培养皿中制成培养板备用；肉汤培养基（上海生工生物工程股份有限公司）：LB液体培养基，高压灭菌备用。

大肠杆菌K-12野生菌菌株（由本研究室保存）；大肠杆菌DH5α感受态细胞、T4 DNA连接酶、细菌基因组DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶PCR扩增试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA和蛋白分子量标准DNA Marker I、DNA Marker IV、DNA Marker D2000（北京天根生物技术公司，批号分别是：CB101、RT406、DP302、KT109、DP209、MD101、MD104、MD114）；大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞（北京全式金生物公司，批号：CD601）；pUCm-T线性载体（上海生工生物工程股份有限公司，批号：B522211）；凝胶电泳迁移实验DNA探针序列由上海生工合成；原核表达载体pET-21b（美国Novagen公司，批号：70763）；限制性内切酶NdeⅠ、HindШ、BamHⅠ（立陶宛Fermentas公司，批号分别是：ER0581、SM0192、ER0051）；小鼠抗His标签单抗、羊抗小鼠IgG/HRP标记二抗（北京中杉金桥生物技术研究所有限公司，批号分别是：TA-02、ZDR-5307）；预染蛋白彩色Marker（7-175KD）（美国BioLabs公司，批号：P7702V）；Biotin 3’End Labeling Kit（美国Thermo公司，批号：89818）；Light Shift Chemilu⁃minescent EMSA Kit（美国Thermo公司，批号：20148）；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 BBR抑菌浓度

BBR对大肠杆菌的最小抑制浓度（Minimum In⁃hibition Concentration，MIC）的确定采用试管二倍稀释法[12]。实验用BBR以灭菌的LB液体培养基溶解配制成1 mg·mL-1的溶液，0.22 μm滤膜过滤除菌，再以LB液体培养基进行二倍稀释为0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1共5个药物浓度梯度。将已培养过夜（约16-18 h）的大肠杆菌菌液，转接100 μL于新鲜LB液体培养基中同条件继续培养2 h，菌生长同步且处于对数生长期，OD600为0.1-0.2（约1×1011CFU·L-1）；然后将菌液用LB液体培养基稀释100倍（约1×109CFU·L-1）作为接种浓度,每试管加入0.1 mL菌液。

实验选用5个药物浓度梯度，每浓度培养液的体积为3 mL，设3个平行组，设立不加实验菌的本底对照；此外，还设立一组含有0.1 mg·mL-1氨苄青霉素的阳性对照组和未加入药物的阴性对照组。加入药物及大肠杆菌的试管于37℃，160 rpm摇床培养22 h后进行判定：轻摇试管见絮状浑浊者为抑菌阴性，澄清者为阳性，阴性的最大药物浓度和阳性的最小药物浓度作为其抑菌范围。同时，测定每管OD600nm，与未加药物的试管进行比较，以观察不同浓度的药物抑制细菌生长的程度。

1.3 大肠杆菌基因组DNA的提取

将已培养过夜（约18 h）的大肠杆菌菌液,转接100 μL于新鲜LB液体培养基中同条件继续培养2 h，当菌体生长至对数生长期（OD600为0.6-0.8时），按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取细菌全基因组DNA。

1.4 大肠杆菌RNA聚合酶α亚基(RNAP-α)高表达重组质粒的构建

以上面提取的基因组DNA为模板，参照NCBI genebank上给出的大肠杆菌K-12 RNA聚合酶α亚基的编码序列，用Primer Premier 5.0软件设计并合成引物，按照如下方法获得目的DNA片段。RNA聚合酶α亚基RNAP-α引物序列：正向：5′-TATGCAGGGTTCT⁃GTG ACGAG-3′，反向：5′-GTACTCGTCAGCGAT⁃GCTTG-3′。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并采用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分离纯化目的DNA片段，将获得的目的DNA片段用T4 DNA连接酶与pUCm-T线性载体连接。将所得到的连接产物取10 μL按照操作手册转化DH5α感受态细胞。用Gene⁃Quant 100紫外分光光度计检测所提质粒DNA的OD260nm和OD280nm，进行浓度标定和纯度检测，-20℃冻存备用。将用上述方法提取的质粒DNA采用双酶切鉴定正反向插入子。挑选正向连接的阳性克隆，扩大培养并用20%的甘油于-80℃保存菌种。取1 mL菌液进行测序，将测序结果与目标DNA序列在DNAman软件中进行生物信息学序列比对。将测序正确的克隆命名为pUCmT-α。将上述测序正确的pUCmT-α菌种扩大培养，并用SDS碱裂解法提取大量pUCmT-α质粒，然后采用NdeⅠ，BamHⅠ双酶切,电泳纯化回收RNAP-αDNA片段，与原核表达载体pET-21b相同的双酶切纯化回收产物用T4 DNA连接酶连接。将连接产物按上面所述方法转化入BL21（DE3）感受态细胞中，涂布含有氨苄青霉素的固体LB培养平板，挑取单克隆并采用双酶切鉴定正确连接的质粒。将正确连接的克隆菌扩大培养，用20%的甘油于-80℃保存菌种，获得的重组质粒命名为pET-21b-α。

1.5 RNA聚合酶α亚基（RNAP-α）的诱导表达及表达条件的优化

将测序正确含有RNA聚合酶α亚基高表达质粒（pET-21b-α）的单克隆摇菌，次日按1∶100转接到LB液体培养基中扩大培养至对数生长期OD600nm=0.6-0.8，取出1mL菌液（诱导前），剩余菌液加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导剂，继续培养4-5 h。同样取诱导后的菌液1 mL，将诱导前、诱导后的菌液分别12 000 rpm，1 min离心收集菌体，弃上清后加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10 min使菌体裂解，用12%SDS-PAGE凝胶电泳检测RNAP-α蛋白是否高表达。同时为了确证高表达的蛋白确实是我们所构建的RNA聚合酶α亚基，采用了Western blot技术对菌体诱导表达的上清液进行鉴定。

1.6 凝胶电泳迁移实验检测BBR对RNAP-α与UP element结合的影响

参照文献[13,14]，根据所研究的目的蛋白及其所结合的保守DNA序列设计并合成DNA探针序列。用Bio⁃tin 3′End Labeling Kit参照说明书分别将UP element-1，UP element-2、-10 element-1、-10 element-2四条单链DNA的3′OH末端标记生物素。凝胶电泳迁移实验DNA探针序列:UP element-1:5′-TCAGAAAAT⁃TATTTTAAATTTCCTCTTGTCAGGC-3′；UP element-2：5′-GCCTGACAAGAGGAAATTTAAAAT-AATTTTCTGA-3′；-10 element-1：5′-CAG GCTTTACACTTTATGCTTCC⁃GGCTCGTATAATGTGTGGA-3′；-10 element-2：5′-TCCACAC ATTATACGAGCCGGA-AGCATAAA GTG⁃TAAAGCCTG-3′。UP element DNA探针与RNA聚合酶α亚基的结合实验参照LightShift Chemiluminescent EMSA Kit说明书进行。在实验过程中，预先将UP ele⁃ ment DNA探针与不同浓度的BBR（0.1、1、10、100 μg· mL-1）孵育后，进行蛋白质与DNA结合反应。通过凝胶电泳可将与RNA聚合酶α亚基结合的探针与游离的探针分离开，最后用化学发光法进行检测。

1.7 凝胶电泳迁移（EMSA）实验考察BBR与核心转录元件结合的偏好性

本实验室之前通过等温滴定（ITC）实验观察到：BBR与模式探针的结合系数随着探针所含TA碱基数量的增加而增加[15]。考虑到细菌启动子元件-10 ele⁃ment也是富含A/T碱基，但其长度比UP element短很多。为了考察BBR在结合力上对TA碱基的偏好性是否是其干扰RNAP-α与UP element结合的原因，我们利用EMSA体外实验检测了BBR对RNAP-б与-10 el⁃ement结合的影响。EMSA具体参照试剂盒操作程序进行。

1.8 Trizol法提取大肠杆菌总RNA

将大肠杆菌K-12野生菌摇菌活化，次日按1∶100转接到LB液体培养基中扩大培养至早期对数生长期OD600nm=0.4-0.6，然后将菌液分配成对照组，实验组（每组采集4个时间点：0.5 h、1 h、2 h、4 h），向实验组中加入BBR溶液，使其终浓度为300 μg·mL-1，接近该药物对大肠杆菌的半数抑制浓度IC50，继续同条件培养至相应时间点，分别离心收集菌体，Trizol法提取RNA[16]。

1.9 Real-time PCR检测特定的基因转录

分别以对照组和实验组各时间点的总RNA为模板，用EasyScript Reverse Transcriptase逆转录试剂盒将样品中的所有RNA反转录为cDNA[17]。以目的检测基因的DNA序列作为模板，用Primer Premier 5.0软件设计并合成用来特异性检测目的基因表达的引物。Sul A(151bp)：正向：5′-CTTCGTCGTTCTCAT CCG-3′，反向：5′-TGCTGACCGAGTTGCTGT-3′；Rec A(138bp)：正向：5′-TGGCGGG TAACCTGAAGCA-3′，反向：5′-CGAGA CGAACAGAG GCGTAGAAT-3′；16S(129 bp)：正向：5′-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3′，反向：5′-A TCTACGATTACTAGCGATTCCA-3′；Lpx C (102 bp)：正向：5′-CGATGAACTTCTCCGCT GATG-3′,反向：5′-G GCCAAACCACGGGACTG-3′；Sec G (147 bp)：正向：5′-CGCTTCCGC TACGCTGTT-3′，反向：5′-TTTTCCCATTCGCTACCTCTATT-3′；Mut T (100 bp)：正向：5′-TT CAGGAAGAGGTCGGGATTAC-3′，反向：5′-ACCAGCCAGAACCACAGAGTTAT-3′。Rpo A(192):正向：5′-GGAAACCAACGGCACAAT-3′，反向：5′-CAGTTA GCA GAGCGGACA-3′。以RNA聚合酶α亚基编码基因Rpo A作为内参基因[18]。Realtime PCR检测按照RealMasterMix（SYBP Green）试剂盒进行[19]。

图1 BBR体外对大肠杆菌生长的抑制作用（n=3）

图2 大肠杆菌RNA聚合酶α亚基编码序列的特异扩增（A）和pUCm-T-α正向连接重组质粒酶切鉴定（B）

1.10 数据处理

2 结果

2.1 BBR对大肠杆菌的抑制浓度

结果显示BBR浓度低于1 mg·mL-1的实验组，试管中均有不同程度的浑浊现象，而1 mg·mL-1实验组培养液仍为澄清；取该实验组培养液100 μL涂布无抗性的LB琼脂平板，37℃、16 h培养后没有明显的菌落出现。综合上述实验观察结果表明BBR对大肠杆菌生长的MIC=1 mg·mL-1。同时测定BBR不同浓度条件下每管菌液在600 nm波长下的吸光值OD600nm，对实验数据进行数据处理结果如图1。根据图1A中各药物浓度条件下大肠杆菌的生长率求得相应的抑制率，代入计算公式求得BBR对大肠杆菌生长的半数抑制浓度IC50=324.19 μg·mL-1。

2.2 大肠杆菌RNA聚合酶α（RNAP-α）亚基编码基因克隆及表达载体的构建

以大肠杆菌基因组DNA序列为模板，进行PCR扩增反应，产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，在约990 bp处出现特异性条带，大小与预期结果相符（图2A）。目的基因RNAP-α的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，与pUCm-T线性载体连接，连接的重组子转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，于37℃、200 rpm培养过夜，经SDS裂解提取质粒后采用NdeⅠ、HindⅢ双酶切鉴定正向连接的重组质粒pUCmT-α，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到与预期相符的约750 bp的酶切片段条带（图2B）。将经过双酶切鉴定并测序正确的pUCmT-α菌种扩大培养，提取大量pUCmT-α质粒，然后采用NdeⅠ，BamHⅠ双酶切，电泳纯化回收RNAP-α DNA片段，与原核表达载体pET-21b相同的双酶切纯化回收产物用T4 DNA连接酶连接。将连接产物转化入BL21（DE3）感受态细胞中，涂布含有氨苄青霉素的固体LB培养平板，挑取单克隆采用双酶切鉴定正确连接的质粒pET-21bα，将测序结果经过比对，相似度100%且无翻译移码。

2.3 RNAP-α亚基的诱导表达及鉴定

pET-21b载体为含有氨苄青霉素抗性基因的原核高效表达载体，且为融合表达载体，其本身表达His-Tag标签蛋白。所表达的目的蛋白RNAP-α分子量约为37 KD。在37℃经IPTG诱导表达的菌体，煮沸裂菌后经12%SDS-PAGE凝胶电泳分析结果显示、在37KD左右有一条明显的高表达蛋白条带（如图3A），与预期的蛋白分子量大小一致，说明重组表达菌pET-21b-α在大肠杆菌中获得了表达。为了进一步确定该高表达条带确实是我们所构建的RNAP-α亚基，通过采用Western blot技术对菌体诱导表达的上清液进行了鉴定，结果显示：利用His-Tag标签抗体进行免疫印迹，在分子量大小约37 KD处检测到单一的蛋白表达条带（如图3B）。

2.4 BBR对大肠杆菌RNAP-α亚基与启动子调控元件结合的影响

EMSA检测实验中，我们以UP element保守序列作为探针，研究了BBR对RNAP-α识别并结合UP ele⁃ment的影响。结果显示：BBR在终浓度为1 μg·mL-1的剂量下，能在体外有效抑制RNAP-α与UP element的结合。利用GraphPad 5.0软件分析计算可知：BBR在该体外结合反应系统中对RNAP-α结合UP element抑制作用的半数抑制浓度IC50为1.311 4 μg·mL-1（图4A-C）。

图3 RNA聚合酶α（RNAP-α）亚基的诱导表达（A）及鉴定（B）

以原核启动子中同样富含A/T碱基的-10 element保守序列作为探针，对BBR对RNAP-б识别并结合-10 element的影响进行研究。结果显示：BBR虽然也能抑制RNAP-б与-10 element的结合，但其抑制效率明显低于其对RNAP-α与UP element结合的影响，提示UP element作用的特异性。BBR在该体外结合反应系统中对RNAP-б结合-10 element抑制作用的半数抑制浓度IC50为15.465 μg·mL-1（图4D-F）。

2.5 Trizol法提取大肠杆菌RNA质量的评价

图4 体外BBR对相关元件结合的影响（n=3）

图5 大肠杆菌RNA提取质量检测及基因组DNA的消化

利用非变性琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA的降解情况（图5A），结果显示Trizol法提取的RNA存在基因组DNA污染，且有一定程度的降解，但23S（2.9 kb），16S（1.5 kb）条带并没有出现明显拖尾现象，可能是非变性电泳时间过长、RNA在电泳过程中有所降解所致。为了检测DNA酶消化处理后RNA样品中基因组DNA残留情况，分别以DNase处理前和处理后的RNA样品为模板，利用PCR扩增特定基因RpoA检测PCR产物。结果显示（图5B）与处理前相对比，用DNase处理后的RNA样品PCR产物没有非特异性条带产生，说明得到了没有DNA污染的RNA样品，为后续的Real-time PCR检测实验结果提供了技术保证。

2.6 BBR对启动子上游含有或不含有UP element调控序列基因转录水平的影响

研究表明大肠杆菌中约有26%的基因启动子上游含有此段保守性较差的UP element序列[20,21]。为了探讨BBR是否通过干扰RNAP-α与启动子上游调控元件UP element的结合而影响含有此段特征序列的基因的转录，我们选择重组蛋白酶A（RecombinaseA，recA），SOS细胞分裂抑制蛋白（sulA），16S核糖体RNA（rrn⁃Bp1）这三个代表基因，采用Real-time PCR的方法检测了BBR处理前后其转录水平的变化情况。

图6 BBR对相关启动子上游调控元件基因转录的影响（n=3）

又文献报道此段富含A/T碱基的UP element特征序列作为一个单独的调控元件，具有明确的激活基因转录启动活性，在被替换到其他基因的核心启动子上游后仍能够激活下游基因的转录[22]。为了探讨BBR是否会通过干扰RNAP-α与启动子上游调控元件UP ele⁃ment的结合而影响含有此段特征序列的基因的转录，我们对比分析了未加药组和BBR药物处理组对特定基因的转录水平影响。同时选择Lpx C、Sec G、Mut T等3个基因作为对比基因，以其启动子上游不含有UP element调控元件。由图6A-C可知：与对照组相比，细菌SOS反应相关的2个重要蛋白—recA、sulA，以及16S核糖体RNA（rrnBp1）这三个启动子上游存在UP element调控元件的基因转录水平被显著下调。图6D-F则表明：Lpx C、Sec G、Mut T等三个启动子上游不存在UP element特征序列的基因转录水平与对照组相比，并没有明显变化。以上结果表明BBR可与启动子上游富含A/T碱基的UP element结合，从而干扰那些受UP element调控的基因的转录起始，影响这些基因的转录以及后续蛋白质的表达。

3 讨论

本研究以大肠杆菌为抑制对象，以TATA为基本观察靶点，对BBR的抑菌作用分子机制进行了初步探讨。BBR对大肠杆菌的MIC=1.0 mg·mL-1，BBR其浓度在达到0.5 mg·mL-1以上时才出现明显的抑菌效果也证明了这一点。这很可能与革兰阴性菌比较特殊的细胞壁组成有关，从而导致BBR不易进入细菌细胞内，此有待于进一步研究。为了在体外探究BBR对RNAP-α与细菌启动子上游调控元件UP element结合的影响，首先，我们需要获得富含RNAP-α的细胞提取物，因此我们构建了RNAP-α重组表达菌；同时，为了尽量使RNAP-α在细胞提取物的上清液中高表达，为了进一步确定细胞裂解液中的高表达蛋白确实是我们所构建的RNA聚合酶α亚基，采用Western blot技术对菌体诱导表达的上清液进行了鉴定，结果显示利用His-Tag标签抗体进行免疫印迹，在分子量大小约37 KD处检测到单一的蛋白表达条带，说明构建的RNA聚合酶α亚基融合蛋白已成功表达，这为我们的后续研究奠定了基础。

有研究指出大肠杆菌RNA聚合酶α亚基由2个独立的结构域组成，分别是N末端结构域（αNTD）和C末端结构域（αCTD），二者之间由一个柔性的linker肽所连接，αCTD的主要功能是负责识别并结合UP element调控序列。在转录起始过程中，αCTD主要通过与富含A/T碱基的UP element的DNA小沟紧密结合参与转录起始复合物的形成。又，BBR能够利用其对“TA”碱基偏好性地插入到DNA双螺旋的小沟中[8]；BBR可以进入真核细胞的细胞核内，并同TATA-box结合蛋白TBP竞争，与mRNA启动子上游调控元件TATA-box结合，干扰基因的转录起始，从而抑制TATA-box依赖的基因的转录[11]。因此，我们希望知道BBR在进入细菌细胞后，是否会与αCTD竞争，结合到富含A/T碱基的UP element DNA序列的小沟中，从而干扰RNA聚合酶α亚基与UP element的结合，影响基因的转录起始。首先，通过体外EMSA试验考察了BBR对RNAP-α与富含A/T碱基的UP element结合的影响；其次，考虑到细菌启动子调控元件-10 element同样富含AT碱基，但其长度比UP element短很多，为了探讨BBR在结合力上对TA碱基的偏好性是否是其干扰RNAP-α与UP ele⁃ment结合的原因，我们考察了BBR对RNA聚合酶б亚基（RNAP-б）与-10 element结合的影响。结果显示：BBR虽然也能抑制RNAP-б与-10 element的结合，但其抑制效率明显低于其对RNAP-α与UP element结合的影响，这与我们实验室之前通过等温滴定实验检测BBR与模式DNA探针结合系数时的实验结果：BBR与模式探针的结合系数随着探针所含TA碱基数量的增加而增加的特点相一致[11]。

BBR作为一种DNA配体，在体外可与双链DNA结合，并且这种结合具有一定的T/A碱基偏好性。BBR的这种对TA碱基的偏好性导致了其在体外有效地抑制RNAP-α与富含A/T碱基的UP element的结合；能极大地影响这些基因的转录效率，因为此段富含A/T碱基的UP element在细菌体内许多含有强启动子的基因上游普遍存在[23]。因此，我们对BBR的这种在体外可干扰RNAP-α与基因转录调控元件UP element结合的现象进行了细菌水平的考察。通过采用实时荧光定量PCR的方法，我们对比分析了未加药组和BBR药物处理组，各时间点特定基因在大肠杆菌内的转录水平变化。

结果表明，BBR能够下调上游富含A/T碱基的UP element的recA、sulA、16S等三个基因的表达，而对于Lpx C、Sec G、Mut T等三个启动子上游不存在UP element特征序列的基因转录水平无明显变化。RecA，sulA蛋白是细菌DNA复制-SOS修复系统中的重要成员，BBR对这两个蛋白转录水平的明显下调提示：BBR不太可能通过引发SOS反应的方式产生抑菌作用。这与之前有文献报道：BBR在SOS反应阴性突变株和野生型菌株中均能引起细胞伸长，抑制细胞分裂的结果相一致[2]；16S rRNA是细菌核糖体的重要组成成分，BBR对其转录水平的明显下调，可能意味着蛋白质合成装置—核糖体的组装将受到影响，细胞存活所必需的结构蛋白和酶类不能被合成，进而抑制细菌的生长。

由于细胞生长的复杂性，BBR在调控这些基因时具体通过影响到哪一种生理功能而发挥其抑菌作用，有待进一步研究。但是UP element及其所含的TATA作为BBR的分子靶点为我们提供了深入探讨BBR对微生物调控的新的视点，有助于探讨由于影响肠道菌所影响的机体多种生理病理功能的紊乱。

1Domadia PN,Bhunia A,Sivaraman J,et al.Berberine targets assembly of Escherichia coli cell division protein FtsZ.Biochemistry,2008,47 (10):3225-3234.

2Boberek JM,Stach J,Good L.Genetic evidence for inhibition of bacteri⁃al division protein FtsZ by berberine.PLoS One,2010,5(10):e13745.

3张茜,朴香淑.小檗碱抑菌作用研究进展.中国畜牧杂志,2010,46 (3):58-61.

4Das S,Kumar GS,Ray A,et al.Spectroscopic and thermodynamic stud⁃ies on the binding of sanguinarine and berberine to triple and double he⁃lical DNA and RNA structures.J Biomol Struct Dynam,2003,20(5): 703-713.

5Li WY,Lu H,Xu CX,et al.Spectroscopic and binding properties of ber⁃berine to DNA and its application to DNA detection.Spectroscopy Lett, 1998,31(6):1287-1298.

6Bhadra K,Maiti M,Kumar GS.Berberine-DNA complexation:New in⁃sights into the cooperative binding and energetic aspects.Biochim Bio⁃phys Acta,2008,1780(9):1054-1061.

7Yadav R C,Kumar G S,Bhadra K,et al.Berberine,a strong polyriboade⁃nylic acid binding plant alkaloid:spectroscopic,viscometric,and ther⁃modynamic study.Bioorganic Med Chem,2005,13(1):165-174.

8Mazzini S,Bellucci M C,Mondelli R.Mode of binding of the cytotoxic alkaloidberberinewiththedoublehelixoligonucleotided (AAGAATTCTT)(2).Bioorg Med Chem,2003,11(4):505-514.

9Ferraroni M,Bazzicalupi C,Bilia AR,et al.X-Ray diffraction analyses of the natural isoquinoline alkaloids Berberine and Sanguinarine com⁃plexed with double helix DNA d(CGTACG).Chem Commun,2011,47 (17):4917.

10 Ozbalci Ç,Unsal Ç,Kazan D,et al.Proteomic response of Escherichia coli to the alkaloid extract of Papaver polychaetum.Annals Microbiol, 2010,60(4):709-717.

11 Wang Y,Kheir M M,Chai Y,et al.Comprehensive Study in the Inhibito⁃ry Effect of Berberine on Gene Transcription,Including TATA Box. PLoS One,2011,6(8):e23495.

12张涛,张爽,胡格,等.盐酸小檗碱绿原酸和黄芩苷对大肠杆菌的体外抑菌作用.中国兽医杂志,2009,45(01):42-43.

13 Gaal T,Ross W,Blatter E E,et al.DNA-binding determinants of the al⁃pha subunit of RNA polymerase:novel DNA-binding domain architec⁃ture.Genes Develop,1996.10(1):16-26.

14 Fenton M S,Lee S J,Gralla J D.Escherichia coli promoter opening and-10 recognition:mutational analysis of σ70.EMBO J,2000,19(5): 1130-1137.

15王玉刚.小檗碱对基因转录过程中TATA box作用的研究.北京：清华大学博士学位论文,2012.

16 Yuan Z Y,Lu X,Lei F,et al.TATA boxes in gene transcription and poly (A)tails in mRNA stability:New perspective on the effects of berberine. Sci Rep,2015,5:18326.

17 Yuan Z,Lu X,Lei F,et al.Berberine inhibits mRNA degradation by pro⁃moting the interaction between the poly A tail and its binding protein PABP.J Chin Pharm Sci,2017,26(1):53-62.

18 Rénia L,Goh S,Boberek J M,et al.Concurrent Growth Rate and Tran⁃script Analyses Reveal Essential Gene Stringency in Escherichia coli. PLoS One,2009,4(6):e6061.

19 Lu X,Yuan Z Y,Yan X J,et al.Comprehensive study of Angelica Dah⁃urica on obesity and fatty liver.Chin J Nat Med,2016,14(9):641-652.

20 Lisser S,Margalit H.Compilation of E.coli mRNA promoter sequences. Nucleic Acids Res,1993,21(7):1507-1516.

21 Rao L,Ross W,Appleman J A,et al.Factor independent activation of rrnB P1:An“extended”promoter with an upstream element that dramat⁃ically increases promoter strength.J Mol Biol,1994:235(5):1421-1435.

22 Gourse R L,Ross W,Gaal T.UPs and downs in bacterial transcription initiation:the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition.Mol Microbiol,2002,37(4):687-695.

23 Ross W,Aiyar S E,Salomon J,et al.Escherichia coli promoters with UP elements of different strengths:modular structure of bacterial promoters. J Bacteriol,1998,180(20):5375-5383.

Experimental Study on Inhibition Effect of Berberine in Escherichia coli Gene Transcription

Li Huiyu1,Wang Yugang1,Yuan Zhiyi2,Lei Fan3,Wang Xinpei1,Lu Xi1,Xing Dongming1,Li Jun1,Du Lijun1
(1.Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences,School of Life Sciences,Tsinghua University, Beijing 100084,China;2.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;

3.School of Pharmaceutical Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China; 4.State Key Laboratory of Innovative Drugs and Efficient Energy-saving Pharmaceutical Equipment, Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330006,China)

There have been many reports on berberine(BBR)effect of the inhibition on gut bacteria,but more from the protein level.In view of the preference of BBR for DNA binding,we here investigated the expression of BBR from the transcriptional expression level of the gene.The results showed that BBR had a higher affinity for UP element of Escherichia coli(E.coli)gene,and the transcription initiation region of this element contained TATA base sequence.The expression of genes sulA,recA and 16S which contain the genes of the UP element regulatory elements in the upstream of the promoter could be suppressed by BBR,and the expression of lpxC,secG and mutT which did not contain the genes of the UP element regulatory elements in the upstream of the promoter could not be inhibited by BBR.It is shown that the TATA sequence is the target of BBR.This result provides a new perspective for exploring the effect of BBRƳs inhibition of microbiota from gene transcription.

Berberine,Escherichia coli,gene transcription,TATA box

10.11842/wst.2017.04.005

R285

A

（责任编辑：郭嫦娥，责任译审：王晶）

2017-02-27

修回日期：2017-04-02

＊国家自然科学基金委重大研究计划培育项目（90713043）：基于BBR神经元保护作用探讨其PI3-K/AKT作用的始动位点及其信号转导，负责人：杜力军；国家自然科学基金委面上项目（81374006）：基于BBR作为DNA插入子探讨其对正常与缺血再灌神经元基因转录作用差异的机制，负责人：邢东明。

＊＊通讯作者：杜力军，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：药理学。