中医药治疗糖尿病肾病临床与基础研究—中日友好医院临床医学研究所李平教授团队学术研究进展

2017-08-07中日友好医院临床医学研究所

世界科学技术-中医药现代化 2017年4期

慢性肾脏病疗效评价重点研究室隶属于国家中医药管理局，依托于中日友好医院临床医学研究所，整合了国家中医药管理局中药药理（肾脏）三级实验室、国家中医药管理局重点学科“中西医结合临床学科”、免疫炎性疾病北京市重点实验室。研究室主任为李平教授。

一、学术研究思路

李平教授师从于我国著名中医肾脏病专家时振声教授，早在20世纪80年代末与时振声教授一起提出“气阴两虚”是慢性肾脏病的发病关键。围绕引起慢性肾功能衰竭的最主要疾病——糖尿病肾病，李平教授带领其团队在临床和基础领域开展系列研究。

糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症，也是患者死亡的重要原因。最新资料表明，我国糖尿病的患病率为11.6%，糖尿病肾病约占糖尿病患者的33.6%。显性蛋白尿是糖尿病肾病疾病进展的重要危险因素，加速了糖尿病肾病进展至终末期肾病。目前，现代医学针对显性蛋白尿缺乏有效的治疗方案。中医药在糖尿病肾病显性蛋白尿的治疗上积累了一定的临床经验，然而缺乏高质量循证医学证据，缺少量化和客观化的评价指标，药物作用机制不清楚，限制了中医药在国内外的推广与应用。

针对上述关键科学问题，李平教授课题组形成了三个主要研究方向：中医药防治糖尿病肾病临床疗效评价研究，中医药防治慢性肾脏病的系统生物学研究，中医药防治慢性肾脏病有效方药及相关机理研究（图1）。

二、团队研究方向与进展

1.中医药治疗糖尿病肾病临床疗效评价研究

1.1 提出治疗糖尿病肾病以“益气活血”为主，“疏肝柔肝”为辅的治疗思路

该团队对近30年来中医药治疗糖尿病肾病的1 464篇临床随机对照研究文献进行了回顾性研究。研究发现，频次大于20%的证候依次为血瘀（89.9%）、气虚（83.4%）、阴虚（66.2%）、肾虚（48.5%）、肝郁（41.8%）、脾虚（31.6%）和湿浊（21.8%）。在此基础上，又通过350例临床病例研究，发现糖尿病肾病患者主要表现为气虚血瘀证，其病机为肝失疏泄，肾络瘀阻，肝肾两虚。该团队创新性地提出治疗糖尿病肾病以“益气活血”为主，“疏肝柔肝”为辅的治疗思路。针对糖尿病肾病微量白蛋白尿期及显性蛋白尿期，分别采用“益气疏肝、活血利湿”和“益气柔肝、活血通络”的方法进行治疗，并研制了有效治疗药物——柴黄益肾颗粒和糖肾方。针对糖尿病肾病显性蛋白尿治疗这一国际难题，重点研究了“益气柔肝、活血通络”方（糖肾方）（图2）。方中黄芪补脾肺之气为君药；生地、山萸肉柔肝滋肾，具有固精（精微）之效为臣药；三七、大黄、鬼箭羽、枳壳，调畅气血，活血通络，推陈致新为佐药，该方获国家发明专利（专利号:ZL 2009 1 0241369.0）。

图1 中医药防治糖尿病肾病临床与基础研究整体思路

图2 糖肾方处方来源与临床研究思路图

1.2 采用国际规范的循证医学方法评价益气活血方药治疗糖尿病肾病的临床疗效

在全国范围内完成了2次糖肾方10家中心、随机双盲、安慰剂平行对照治疗糖尿病肾病的临床试验。首次临床试验于2007年4月至2009年12月间，在北京、上海、河北唐山等地6家三甲医院进行（注册号：ChiCTR-TRC-10000843，中日友好医院伦理号：2006-059）。共纳入180例气虚血瘀证2型糖尿病肾病（符合微量白蛋白尿期和显性蛋白尿期）患者，随机分为糖肾方组和安慰剂对照组。糖肾方组：ACEI/ARB加糖肾方（配方颗粒）；安慰剂组：ACEI/ARB加安慰剂（配方颗粒），共计给药24周。研究结果显示：糖肾方改善了显性蛋白尿期患者倦怠乏力、肢体麻木等气虚血瘀相关症状，与安慰剂比较差异显著（P=0.0371）。在微量白蛋白尿期，糖肾方治疗组在减少尿蛋白排泄和改善肾小球滤过率方面与国际公认的一线用药ACEI/ARB疗效一致，在延缓肾功能进展方面更具优势；在显性蛋白尿期，尿蛋白排泄增加，肾小球滤过率呈进行性下降，此时ACEI/ARB加安慰剂治疗无法阻止疾病进展，在此阶段糖肾方明显起到了降低24 h尿蛋白定量，提高肾小球滤过率的治疗作用（图3）。第2次临床试验（注册号：ChiCTR-TRC-13003566，中日友好医院伦理号：2013-046）进一步证实了糖肾方改善糖尿病肾病显性蛋白尿期患者肾功能作用。课题组验证了“益气柔肝、活血通络”方药为糖尿病肾病显性蛋白尿的治疗提供了新的有效措施，阻止了糖尿病肾病的进一步恶化。

图3 糖肾方治疗糖尿病肾病临床疗效分析

1.3 利用定量代谢组学方法评价“益气柔肝、活血通络”方治疗糖尿病肾病的临床疗效

中医药临床疗效评价的客观化一直备受关注。目前认为，西医公认的实验室指标、生存量表、中医症状积分表等指标不能完全体现和评价中医疗效。新陈代谢是生命活动的基本形式。一切生命活动最终都会体现到一定的代谢状态中。因此，本团队采用代谢组学方法评价了中药治疗糖尿病肾病的临床疗效。进一步对上述临床试验研究过程中采集的中药组（西医常规治疗+糖肾方）和对照组（西医常规治疗+安慰剂）治疗前、治疗12周和治疗24周的血液样本进行了代谢组学的检测。首先采用定量代谢组学方法，筛选了药物干预疾病过程中代谢变化的潜在生物标志物PC、LysoPC、PE、LysoPE、SM、TG等磷脂类和一些嘌呤/嘧啶类。其次，比较两种治疗方法的治疗差异，两组导致代谢物含量变化幅度有明显差异，中药组较对照组有明显优势，治疗后更接近正常人，提示疗效更明显。最后，中药组与治疗前、正常对照组进行差异比较，随着治疗时间的延长，代谢物含量越接近正常人水平（图4）。结果显示，糖肾方可逆转糖尿病肾病显性蛋白尿期患者的代谢紊乱。该研究为解决中医药临床疗效的不稳定和难以重复提供了新的研究途径。

肝型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）是肾损伤的标志分子，可作为糖尿病肾病早期诊断、疾病进展的评估及监测的标志物。在正常人群、糖尿病、糖尿病肾病微量白蛋白尿和显性蛋白尿患者中，尿LFABP水平呈逐渐升高趋势。临床研究发现，糖肾方可显著降低糖尿病肾病微量白蛋白尿和显性蛋白尿患者L-FABP水平（图5）。

从临床常规实验室指标、系统生物学指标体系和机制相关分析多个层面证实了“益气柔肝、活血通络”方治疗糖尿病肾病的临床疗效，为其推广应用提供了可靠的临床研究证据。

图4 糖肾方治疗后糖尿病肾病患者潜在标志物含量变化趋势图

2.中医药防治慢性肾脏病的系统生物学研究

2.1 创建糖尿病肾病临床-基础相结合的多系统整合生物标志物体系

为了提高糖尿病肾病的早期预警，项目组在临床研究的基础上，将1 400例横断面研究和350例系统生物学分析结果相结合，从代谢组学、蛋白质组学、基因组学等多个层面分析了益气活血药物治疗糖尿病肾病的分子标志物。在此基础上，将其与临床理化指标、中医证候、中医症状等进行相关性分析，创建了糖尿病肾病临床-基础相结合的多系统整合生物标志物体系，为糖尿病肾病早期预警提供了多系统整合生物标志物体系，为益气活血药物治疗糖尿病肾病提供了科学依据（图6）。

2.2 利用系统生物学方法揭示了益气活血方药治疗糖尿病肾病显性蛋白尿的疗效机制

为了揭示益气活血方药治疗糖尿病肾病显性蛋白尿的作用机制（图7），本团队通过网络药理学方法发现了益气活血方药中22种入血成分所对应的73个潜在作用靶蛋白，构建了调控作用网络；采用项目组创立的化学物质组学方法，通过“自上而下，逐层递进”的组效相关研究，发现了黄芪总黄酮、三七总皂苷及柴胡总皂苷为益气活血方药中主要有效组分，其中毛蕊异黄酮苷和柴胡皂苷-d为君药的最主要单体有效成分；整合基因组学、定量代谢组学及药理研究发现：益气活血方药通过调控ABCA1/ RXR通路改善脂代谢紊乱及磷脂代谢异常，减轻了脂毒性对滤过膜的损伤；进而，项目组发现抑制NF-κB通路诱导的炎症因子异常升高，阻断miRNA21介导的TGF-β/Smad通路减少了纤维化I、IV型胶原积聚，通过调控JAK/STAT/SOCS通路同时改善了炎症与纤维化，减少其对肾小球滤过屏障及肾小管重吸收功能的损害，降低了尿蛋白排泄。

2.3 代谢组学研究发现益气活血方药通过抑制肝脏有机毒素分子代谢改善肾脏损害的新机制

图5 糖肾方改善糖尿病肾病患者尿L-FABP水平趋势图

图6 创建了临床-基础相结合的多系统整合生物标志物体系

本团队率先采用代谢组学方法在国际上报道有机毒素（尿毒素和葡萄糖甘酸物质）在糖尿病肾病大鼠肾皮质中含量明显升高，且与蛋白尿及肾小管间质损伤程度有显著正相关。尿毒素分子主要在肝脏合成，并从血浆经肾小管主动排泌。血中尿毒素浓度升高，可损伤肾小管，促进肾小球硬化和小管间质纤维化，加剧糖尿病肾病进展。实验结果证明，益气活血方药显著抑制肝脏尿毒素分子生物合成及其在肾脏的蓄积，降低对肾脏的损伤，其综合作用优于蒙诺，为该研究从肝论治糖尿病肾病提供了有力的实验证据（图8）。

2.4 蛋白质组学研究发现糖尿病肾病发病机制中起重要作用的潜在靶蛋白和益气活血方药的作用靶标

本团队利用2型自发性糖尿病肾病模型OLETF大鼠和遗传背景相似但不发病的LETO大鼠，运用2DE-MALDI-TOF技术对大鼠肾皮质进行了亚差异蛋白质组学研究。与LETO大鼠相比，OLETF大鼠肾皮质中编码ETFb、EPHX2等9个蛋白的基因发生了多个位点的错义突变。通过信息生物学分析这些突变可能在糖尿病肾病发生发展过程中起着重要作用。而糖肾方干预OLETF大鼠的肾皮质中3种可溶蛋白（BOP1NT、rCG56248、Cryab）和4种难容蛋白（Vcl_predicted，MYL6，Uqcrfs1，Gpx3）表达降低；6种可容蛋白（Tsta3、Lactb2、Ech1、Psma1、Gsto1、Hmgb1）及5种可容蛋白（Timm，Atp6v1e1、Ppia、LOC683519、Dmgdh）表达增高（图9）。提示糖肾方对肾病糖尿病的治疗作用可能是通过调控上述蛋白来实现的。

图7 益气活血方治疗糖尿病肾病蛋白尿分子机制研究模式

2.5 利用基因组学研究揭示益气活血方药改善糖尿病肾损伤的分子靶标及其作用机制

为了进一步探索益气活血方药治疗糖尿病肾病的分子靶标，项目组选用db/db小鼠作为2型糖尿病模型鼠，糖肾方干预可以明显减轻db/db小鼠肾损伤。基于基因表达谱芯片数据以及体内、体外实验分析，表明了PLZF可能是糖肾方治疗糖尿病肾病的分子靶点。在糖尿病状态下，高糖可显著上调肾小管上皮细胞中PLZF的表达水平，抑制细胞自噬水平，进一步抑制胶原Ⅲ的自噬性降解，导致肾小管上皮细胞的胶原沉积。而糖肾方可通过下调PLZF的表达，减轻肾小管上皮细胞的胶原沉积，改善糖尿病肾损伤（图10）。

图8 益气活血方药抑制肝脏尿毒素合成，保护肾脏

图9 蛋白质组学研究发现益气活血方治疗糖尿病肾病的靶蛋白

3.药物有效成分与作用机制研究

3.1 利用4种实验动物模型证实益气活血方药治疗糖尿病肾病显性蛋白尿优于ACEI/ARB类药物

为了更好地评价益气活血方药改善糖尿病肾病显性蛋白尿的药效学作用，项目组以ACEI/ARB（蒙诺/安博维）为阳性对照药，分别利用自发性2型糖尿病肾病db/db小鼠或OLETF大鼠模型；单侧肾切除合并链脲佐菌素诱导糖尿病肾病或高脂饮食合并链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠模型针对益气活血方药（柴黄益肾颗粒和糖肾方）开展了系列实验研究（图11）。研究证实了益气活血方药在降低24h尿蛋白排泄、改善肾脏组织病理损伤方面均显著优于阳性对照药蒙诺/安博维，为临床试验结论提供了强有力的实验支撑依据。

3.2 揭示益气活血方药抑制糖尿病肾病炎症和纤维化分子机制

糖尿病肾病是一种炎症性疾病，随着病程进展最终出现肾脏纤维化。在益气活血法的指导下，项目组针对糖尿病肾病早期微量白蛋白尿采用“益气疏肝、活血利湿”的柴黄益肾颗粒治疗，发现该药物主要通过改善糖尿病肾病的微炎症状态，从而起到肾脏的保护作用。针对糖尿病肾病的显性蛋白尿，项目组采用“益气柔肝、活血通络”的糖肾方治疗，发现该药物主要通过抗炎和抗纤维化作用，有效治疗糖尿病肾病中晚期病变，减轻了肾小球硬化和肾小管间质纤维化，减少了尿蛋白的排泄。NF-κB信号通路和TGF-β/Smad3通路是介导糖尿病肾病炎症和纤维化的关键通路。益气活血方药通过抑制Smurf2表达，减少smad7水解，从而一方面促进IκBα表达，抑制NF-κB驱动的炎症反应；一方面降低Smad2/3磷酸化水平，减轻TGF-β/Smad3介导的肾脏纤维化（图12）。

3.3 基于Luficerase Reporter技术评价了糖肾方及其组分调控糖尿病肾病相关信号通路

图10 基因组学研究发现了益气活血方通过调控PLZF表达改善糖尿病肾病的分子机制

图11 益气活血方减少糖尿病肾病蛋白尿，改善肾组织病理损伤优于ACEI/ARB类药物

图12 揭示益气活血方药抑制糖尿病肾病炎症和纤维化机制

为了进一步优化糖肾方组方配伍，阐释物质基础，我们与耶鲁大学医学院药理系郑永齐教授合作，利用其实验室建立的Luciferase reporter信号通路药物筛选技术平台，选择与糖尿病肾病发生发展密切相关的TGFβ/Smad、AP-1、STAT3、NF-κB及NRF2 5个信号通路，对糖肾方2种不同提取方法，4种配伍组合、7个单味中药及其中10个单体化合物进行了筛选评价。研究发现糖肾方中的枳壳、卫矛和大黄对TGFβ1/smad通路和AP-1通路具有抑制的作用，而方中的黄芪对NRF2通路明显的上调作用，其中的有效成分为毛蕊异黄酮-7-β-O-D-葡萄糖苷（图13、图14）。

3.4 阐释益气活血方药改善糖尿病脂代谢紊乱的分子机制

临床与基础研究发现，益气活血方药（糖肾方）具有调节血脂水平的作用。肝脏是胰岛素抵抗的靶器官及脂代谢的重要场所，糖尿病患者体内游离脂肪酸水平升高激活炎症通路，肝脏和肾脏一方面成为炎症因子作用的靶器官，也是炎症因子产生器官，释放加重系统性炎症反应，加快脂肪肝和DN的病理进程。课题组采用自发性糖尿病小鼠模型db/db小鼠，发现糖肾方可降低db/db小鼠体重及肝脏系数，降低血脂水平，显著改善db/db小鼠的脂质代谢紊乱和肝脏脂肪变；该保护作用与糖肾方通过AMPK/SREBPs及其下游靶基因显著抑制db/db小鼠肝组织脂质生成、通过Sirt/PGC1α增加肝组织与骨骼肌脂肪酸氧化利用，同时调节PI3K/Akt/mTOR信号通路及巨噬细胞活化等代谢途径相关（图15）。

三、研究团队及主要科研成果

李平，女，汉族，医学博士，主任医师，研究员，中国医学科学院协和医科大学及北京中医药大学博士生导师。师从于我国著名中医肾脏病专家时振声教授，于1997年7月获得中国中医研究院中医内科博士学位；1999年5月于日本新泻大学肾脏病研究所获得基础医学博士学位。主要研究方向为中医药治疗慢性肾脏病的临床与新药开发研究。2003年被评为国家留学回国先进个人；2007年被评为国家中央机关优秀女科技工作者、国家首届杰出女中医师。2007-2008年度卫生部有突出贡献的中青年专家，获国务院政府特殊津贴；2011年获“十一五”国家科技计划执行突出贡献奖。社会兼职10余项，包括世界中医药学会联合会临床用药安全研究专业委员会会长，中国中医药研究促进会糖尿病专业委员会副主任委员，世界中医药学会联合会第二届内科肾脏病专业委员会副会长等。

图13 基于荧光素酶报告基因系统的中药复方有效成分筛选思路

图14 利用荧光素酶报告基因系统筛选了糖肾方治疗糖尿病肾病药味及成分

李平教授团队现有16位在职人员，其中研究员1人，副研究员4名、助理研究员6人、主治医师2人，副主任技师2名，10人拥有博士学位，6人曾在日本、美国和香港等地访问学习。该团队承担国家973项目、科技部国际科技合作项目、科技部“十二五”重大专项、国家自然基金委重点国际合作研究项目、国家自然科学基金面上/青年项目等国家级课题15项，省部级科研课题10项。获得科技奖励10项，包括国家科技进步二等奖1项、中华中医药学会科学技术一等奖1项、北京市科技进步二等奖1项、中华中医药学会科技著作一等奖1项等；获得国家发明专利5项；发表学术论文二百余篇，其中SCI论文64篇。出版学术著作9部。先后出站博士后2名，培养博士研究生21人，硕士研究生17人。

该团队是国内较早开展国际合作科研项目的单位。2006年与加拿大马尼托巴大学、日本新泻大学合作承担科技部国际科技合作专项，2012年与美国耶鲁大学、香港中文大学合作承担科技部国际合作项目，2012年与加拿大英属哥伦比亚大学合作承担科技部国际合作项目。自2012年，团队邀请海内外知名专家，先后承办“中西医结合防治糖尿病并发症高峰论坛”、“肾科医生中西医结合基础与临床学术论坛”、“学科建设、科学研究高峰论坛”和“中西医结合治疗糖尿病肾病临床论坛”。2016年李平教授以北京市重点实验室为依托，成立了世界中医药学会联合会临床用药安全研究专业委员会，并举办“肝肾疾病临床合理用药与安全评价研究进展”国际论坛。团队秉承开放原则，积极开展国际合作与交流，推动中医药国际化进程。