胆固醇性肺炎中TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达及意义

康丽菲，邸红芹，朱桂云，安晓颖，陈 宁，杨永辉*

(1.河北省胸科医院病理科，河北 石家庄 050041；2.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041)

·论 著·

胆固醇性肺炎中TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达及意义

康丽菲1，邸红芹2，朱桂云1，安晓颖1，陈 宁1，杨永辉1*

(1.河北省胸科医院病理科，河北 石家庄 050041；2.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041)

目的检测Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和核因子-κB p65(nuclearfactor-kappaB p65，NF-κB p65)在胆固醇性肺炎泡沫细胞中的表达水平，探讨三者在胆固醇性肺炎发生中的作用、相互关系及临床意义。方法选择手术切除标本经病理证实为胆固醇性肺炎45例，普通型肺炎(对照组)25例，采用免疫组织化学方法检测2组TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达水平。结果胆固醇肺炎泡沫细胞中TLR4蛋白阳性表达率、MyD88蛋白和NF-κB p65蛋白强阳性表达率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TLR4阳性表达率、MyD88和NF-κB强阳性表达率均与性别不相关(P>0.05)。年龄<50岁者胆固醇肺炎泡沫细胞中TLR4阳性表达率、MyD88和NF-κB p65强阳性表达率均明显高于年龄≥50岁者，差异有统计学意义(P<0.05)。TLR4与MyD88、TLR4与NF-κB p65、NF-κB p65与MyD88在胆固醇性肺炎的表达中均呈明显正相关(r=0.476、0.523、0.491,P<0.05)。结论TLR4、MyD88和NF-κB p65的阳性表达可能与胆固醇性肺炎的发生发展有关，三者可能在胆固醇性肺炎的发病中起协同作用。随着年龄增长，三者表达的阳性率均降低。

胆固醇性肺炎；Toll样受体4；髓样分化因子88；NF-κB

胆固醇性肺炎是一种罕见的肺炎，即内源性脂质性肺炎[1]。根据肺内脂类物质来源不同分为外源性脂质性肺炎和内源性脂质性肺炎[2]。外源性脂质性肺炎可能与吸入动植物性或矿物油脂有关[3]。胆固醇性肺炎由于阻塞或其他原因，肺内脂类积聚或脂类代谢紊乱，光镜下典型表现为肺泡内及肺泡间隔出现大量泡沫细胞。临床可以无症状或胸痛、咳嗽、咳痰、咳血等。CT检查可能出现条索影或肿块影，与肿瘤很难鉴别。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Ⅰ型跨膜蛋白，主要分布在淋巴组织和防御功能细胞中，调节体内炎症反应，在天然免疫中起极其重要的作用。有研究表明TLR4参与动脉粥样硬化泡沫细胞形成[4]。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是一种含有TLR结构域的接头蛋白，是TLR信号通路中重要因子，激活下游多种信号。核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)是一个多向性核转录因子，将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达来调节炎症免疫等。动脉粥样硬化中，TLR4与MyD88结合，激活下游信号，NF-κB活化发生核转位，白细胞介素1( interleukin-1, IL-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor -α，TNF-α)等炎症因子被释放，诱导吞噬细胞转化为泡沫细胞[5]。此通路是否在胆固醇性肺炎中起作用尚无研究。本研究应用免疫组织化学方法观察TLR4、MyD88和NF-κB蛋白在胆固醇性肺炎泡沫细胞中的表达情况，探讨TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在胆固醇性肺炎发病机制中的可能作用及相互关系，旨在为临床诊疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2003—2017年河北省胸科医院病理科经手术切除并经病理证实为胆固醇性肺炎的肺标本45例。男性28例，女性17例，年龄6～68岁，中位年龄43岁。另选择没有泡沫细胞形成的普通型肺炎(对照组)25例，男性13例，女性12 例，年龄20～60岁，中位年龄45岁。2组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 试剂 TLR4抗体(浓度1∶100)、NF-κB抗体(浓度1∶300 )和MyD88抗体(浓度1∶150)均为鼠抗人单克隆抗体，购自英国Abcam公司。免疫组织化学两步法试剂盒PV6002，购自北京中杉金桥有限公司。

1.3 免疫组织化学染色 蜡块切片4 μm，60 ℃烤片40 min，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浸泡各10 min，梯度酒精脱水，自来水冲洗，PBS冲洗，乙二胺四乙酸抗原修复92～95 ℃，15 min，PBS冲洗，3% H2O2室温浸泡10 min, PBS冲洗。滴加一抗(TLR4，MyD88，NF-κB p65)，4 ℃过夜,阴性对照用PBS代替一抗。PBS冲洗，滴加二抗,室温孵育1 h (避光操作)。PBS冲洗。二氨基联苯胺显色。苏木素复染,水洗后梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下观察结果。

1.4 TLR4、MyD88和NF-κB免疫组织化学判断标准 TLR4和MyD88着色部位均为泡沫细胞和吞噬细胞的胞膜和胞质中出现棕黄色颗粒， NF-κB在泡沫细胞和吞噬细胞的胞质及胞核中出现棕黄色颗粒，高倍镜下(×400)随机观察10个视野，总计1 000个细胞，染色强度无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。根据阳性细胞百分比<25%为0分,25%～50%为1分，>50%～75%为2分，>75%为3分。2项再相乘，0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，≥4分为强阳性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理组织学形态观察结果 胆固醇性肺炎的光镜下表现为肺泡腔内出现泡沫细胞聚集，可见胆固醇裂隙及多核巨细胞，间质内可见淋巴细胞、浆细胞为主的炎性细胞浸润。肺泡上皮转为立方上皮，显示腺样肺泡结构。在肺泡间隔内，出现由淋巴细胞增生聚集而成的小团块，像花蕾样突入肺泡道内，似淋巴滤泡，但无生发中心。周围可见纤维化，胶原形成。见图1。

2.2 免疫组织化学染色结果 TLR4蛋白在炎细胞、泡沫细胞及吞噬细胞的胞浆和胞膜中阳性表达，呈棕黄色颗粒。MyD88蛋白在炎细胞、泡沫细胞及吞噬细胞的胞浆和胞膜中阳性表达，呈棕黄色颗粒。NF-κB蛋白在肺泡上皮、炎细胞、泡沫细胞及吞噬细胞的胞浆和胞核中阳性表达，呈棕黄色颗粒。胆固醇肺炎泡沫细胞中TLR4蛋白阳性表达率明显高于对照组，MyD88蛋白和NF-κB蛋白强阳性表达率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图2～6。

表1 TLR4、MyD88、NF-κB p65在胆固醇性肺炎泡沫细胞及对照组吞噬细胞中的表达Table 1 The expression of TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in the foam cells of cholesterol pneumonia and macrophages of the control (例数，%)

图1 胆固醇性肺炎泡沫细胞聚集(HE ×100)

2.3 不同性别、年龄胆固醇肺炎泡沫细胞中TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达 不同性别间TLR4阳性表达率、MyD88和NF-κB强阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)；年龄<50岁者胆固醇肺炎泡沫细胞中TLR4阳性表达率、MyD88和NF-κB p65强阳性表达率均明显高于年龄≥50岁者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 胆固醇性肺炎中TLR4、MyD88、NF-κB p65在不同性别、年龄的表达Table 2 The expression of TLR4，MyD88，NF-κB p65 with the sex and age in cholesterol pneumonia (例数，%)

2.4 TLR4、MyD88和NF-κB p65在胆固醇性肺炎中表达相关性分析 TLR4与MyD88、TLR4与NF-κB p65、NF-κB p65与MyD88在胆固醇性肺炎的表达中均呈明显正相关(r=0.476、0.523、0.491,P<0.05)。

3 讨 论

胆固醇性肺炎又名内源性脂质性肺炎，曾称为石蜡瘤[6]和肺泡组织细胞增生症[7]等。光镜下表现为肺泡腔内出现大量泡沫细胞。通常与周围最近的阻塞性病变有关，如放化疗后的坏死组织、脂类物质沉积或高脂血症等。国内外对此病的报道大多为个案报道，对其发病机制研究甚少。本研究探讨胆固醇性肺炎的发病机制，旨在为对临床诊治提供理论依据。

TLR4是最早鉴定的人类Toll样受体。TLR4基因位于第9号染色体，编码蛋白属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区三部分组成[8]。胞外区可与CD14结合介导蛋白之间的相互作用。髓样分化因子2(myeloid differentiationprotein 2,MD2)与TLR4相连形成TLR4/MD2受体复合物。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与LPS绑定蛋白(内毒素结合蛋白LBP)结合，再与CD14结合能促进LPS单体向TLR4/MD2 复合物转移，增强LPS的识别[9]。胞内区在信号传导中起主导作用，与IL-1受体胞内区同源，被称为Toll/IL-1受体结构域。TLR4与多种刺激因子结合如脂多糖[10]、热休克蛋白60、高迁移率族蛋白B1、表面活性剂A、硫酸肝素片段等，通过MyD88依赖和非依赖途径最终导致NF-κB激活，引起炎症因子和趋化因子的分泌，发挥相应的生物学作用。有研究发现，TLR4在泡沫细胞形成过程中可能起一定作用，参与动脉粥样硬化形成[11]。本研究结果显示，胆固醇性肺炎泡沫细胞中TLR4阳性表达率(73.33%)明显高于对照组(20.00%)。提示TLR4在胆固醇性肺炎的发生发展中可能起一定作用。

MyD88属于Toll/IL-1R家族和死亡结构域家族成员, 由N端的死亡结构域、中间区域及C端的TIR结构域组成[12]，是TLR信号途径中的重要接头蛋白，在免疫应答中起重要作用。在细胞静息状态下，MyD88以非活性形式与肌动蛋白结合形成复合物，活化时与TLR家族蛋白结合激活下游信号。NF-κB作为淋巴细胞中一种可诱导的转录因子由Sen等[13]首次报道。由Rel家族5种蛋白成员以同源/异源二聚体组成，包括2组：第一组RelA(p65)、RelB、c-Rel，第二组NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)。p50或p52能与p65、c-rel、RelB形成异二聚体，其中NF-κB p65/p50在细胞中分布最广泛。当细胞激活时，NF-κB进入细胞核通过绑定在多种基因启动子和增强子的DNA序列中调节目的基因表达[14]。编码前炎症细胞因子和趋化因子等基因转录[15]，激活单核/巨噬细胞、中性粒细胞等发挥抗炎作用。此通路可在多种疾病中发挥作用，如动脉粥样硬化、炎性病变[16]、癌症[17]等。有研究报道，抑制肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA表达和NF-κB活化，减少炎症因子的产生和释放，能改善患者的氧合功能，增强肺功能[18]。

本研究结果显示，MyD88和NF-κB在胆固醇性肺炎中强阳性率均明显高于对照组(P<0.05)。TLR4与NF-κB和MyD88表达均呈明显正相关。提示TLR4/MyD88/NF-κB通路在胆固醇性肺炎的发生中起重要作用，三者可能有协同作用。

有研究显示，胆固醇性肺炎主要原因可能与近端气道阻塞、吸入刺激性粉尘颗粒、肺部寄生虫病或者脂类代谢的不平衡等有关[19]。其发病机制可能与肺损伤有关，肺内吞噬细胞在静息状态时，NF-κB复合物是失活的，主要定位在胞浆与其抑制剂IκB蛋白结合，当肺泡细胞膜退变时导致胆固醇或其他脂类物质释放到肺泡中，脂多糖等与吞噬细胞表面TLR4结合时，细胞活化，细胞内的MyD88通过其c端的TIR结构域与TLR4相互作用，随后MyD88 N端的死亡结构域招募IL-1R相关蛋白激酶(IL-1R associated kinase,IRAK)，IRAK自身磷酸化激活，脱离MyD88，与肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6,TRAF6)[20]结合并使其活化，进而激活由β转化生长因子激活的蛋白激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)，促进其与TAK1绑定蛋白2,3的结合，激活IKK复合物(由IKKa、IKκB和调节蛋白Ikkγ组成)，使I-κB泛素化，I-κB与NF-κB解离，NF-κB进入细胞核，激活相关基因转录，产生炎症因子IL-1、IL-6、IL-8等，诱导吞噬细胞转化为泡沫细胞。

本研究结果显示，不同性别间TLR4阳性表达率、MyD88和NF-κB p65强阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)；年龄<50岁者胆固醇肺炎泡沫细胞中TLR4阳性表达率明显高于年龄≥50岁者，MyD88和NF-κB p65强阳性表达率明显高于≥50岁者，差异有统计学意义(P<0.05)。表明年龄越大，TLR4、MyD88和NF-κB p65阳性表达越低。可能年龄越大，机体的防御反应越差，与炎症有关的因子释放也较少， TLR4/MyD88/NF-κB信号通路受到一定程度抑制。

本研究仅从免疫组织化学方面进行了一些研究，对TLR4/MyD88/NF-κB通路在体内调节多种免疫和自稳态平衡以及在胆固醇性肺炎发生中起重要作用的认识也是只冰山一角，尚需要进一步深入探讨。

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(本文编辑：赵丽洁)

Expression and significance of TLR4, MyD 88 and NF-κB p65 in cholesterol pneumonia

KANG LI-fei1, DI Hong-qin2, ZHU Gui-yun1，AN Xiao-ying1, CHEN Ning1, YANG Yong-hui1*
(1.DepartmentofPathology，theChestHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050041，China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory，theChestHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050041，China)

Objective To detect the expression of Toll-like receptor 4(TLR4), Myeloid differentiation factor 88(MyD88)and nuclear factor-κB p65(NF-κB p65) in cholesterol pneumonia foam cells, and to investigate their roles and relationship in the occurrence of cholesterol pneumonia and clinical significance. Methods The expression of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 in 45 cases of foam cells of cholesterol pneumonia and 25 cases of macrophages of usual pneumonia without the aggregation of foam cells(control groups) from surgically resecting specimens of lung that was confirmed by pathology was immunohistochemically studied. Results The strong positive rate of MyD88 and NF-κB p65, as well as the positive rate of TLR4, was obviously higher than that in the control(P<0.05) The positive expression of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 was not related with sex(P>0.05).The expression rate of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in patience below 50 was more significant higher than the patience above 50(P<0.05). Among the 45 cases of cholesterol pneumonia , there were apparently positive correlation between TLR4 and MyD88, TLR4 and NF-κB, NF-κB p65 and MyD88(r=0.467, 0.523, 0.491,P<0.05),as well as the positive correlation. Conclusion The expression of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 may be involved in pathogenesis of cholesterol pneumonia presenting their synergistic effect in cholesterol pneumonia, which was not related to the sex but age. With the increase in age of the cholesterol pneumonia, the positive rate of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 was decreased.

cholesterol pneumonia； Toll-like receptor 4； myeloid differentiation factor 88； NF-kappa B

2017-04-18；

2017-05-06

河北省医学科学研究重点课题(ZL20140205)

康丽菲(1981-)，女，河北赵县人，河北省胸科医院主治医师，医学硕士，从事病理学诊断研究。

*通讯作者。E-mail:yonghuiyang@vip.163.com

R563.1

A

1007-3205(2017)06-0680-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.06.015