微小RNA-92a联合胃蛋白酶原在胃癌中的诊断价值

牛巍巍，杨春春，段志英，霍晓辉

(河北医科大学第一医院消化内科，河北 石家庄 050031)

·论 著·

微小RNA-92a联合胃蛋白酶原在胃癌中的诊断价值

牛巍巍，杨春春，段志英，霍晓辉

(河北医科大学第一医院消化内科，河北 石家庄 050031)

目的探讨微小RNA(microRNA，miRNA)-92a联合胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)在胃癌诊断中的价值及临床意义。方法选择胃癌患者60例，慢性萎缩性胃炎患者141例，慢性非萎缩性胃炎患者162例，采用实时荧光定量PCR检测miRNA-92a，胶体金免疫层析法检测PG，分别计算miRNA-92a、PG以及miRNA-92a联合PG对胃癌诊断的敏感度及特异度。结果胃癌组血浆miRNA-92a表达量高于慢性萎缩性胃炎组和非萎缩性胃炎组，慢性非萎缩性胃炎组血浆miRNA-92a表达量低于慢性萎缩性胃炎组(P<0.05)。胃癌组血浆 PGⅠ和PGⅠ/PGⅡ均低于慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组，慢性萎缩性胃炎组PGⅠ/PGⅡ低于慢性非萎缩性胃炎组(P<0.05)；慢性萎缩性胃炎和慢性非萎缩性胃炎PGⅠ比较差异无统计学意义(P>0.05)。miRNA-92a诊断胃癌的敏感度和特异度分别为85.70%和70.8%；PG诊断胃癌的敏感度和特异度分别为75.80%和84.90%；miRNA-92a联合PG诊断胃癌的敏感度和特异度分别为86.49%和89.32%。结论miRNA-92a联合PG检测诊断胃癌的效能优于单一检测。

胃肿瘤；微RNAs；胃蛋白酶原

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均居我国恶性肿瘤第2位，严重影响着人民的生命健康[1-2]。如何降低我国胃癌的发病率和病死率是目前亟待解决的重大公共卫生问题。而胃癌的预后与诊断的时间密切相关，如果为进展期胃癌，即使进行了手术治疗，5年生存率仍低于60%；但如果能够早期发现、早期诊断胃癌，则5年生存率大于90%[3]。胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)作为重要的胃癌血清学筛查手段，在临床中单独应用具有一定的局限性。微小RNA(microRNA，miRNA)-92a在胃癌患者血清中高表达。本研究旨在探讨miRNA-92a联合PG在早期胃癌筛查中的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年10月—2016年12月河北医科大学第一医院消化内科住院患者及要求行内镜检查健康体检者363例，其中胃癌患者60例，男性36例，女性24例，年龄26～82岁，平均(58.46±12.67)岁；慢性萎缩性胃炎患者141例，男性68例，女性 73例，年龄20～81岁，平均(55.92±15.61)岁；慢性非萎缩性胃炎患者162例，男性79例，女性83例，年龄20～80岁，平均(57.53±16.12)岁。所有病例均经过病理组织学证实，并排除急性上消化出血，无特殊用药史及无心、肝、肾等疾病。3组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究获得医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 实验材料 PG ELISA试剂盒购于北京康美生物技术研究中心，Trizol试剂购于美国Invitrogen生物；内参U6、微小miRNA-92a引物购自广州复能基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血浆中miRNA-92a测定 按照TrizoL试剂盒说明书提取血浆总RNA，测定RNA提取液的OD260吸光光度值，进一步计算浓度及纯度，应用琼脂糖凝胶电泳，检测RNA完整性。应用实时荧光定量PCR检测miRNA-92a的表达；相对miRNA表达水平用CT值准确计算，U6snRNA为内参。microRNA-92qRT-PCR引物序列：5′-TATTGCACTTGTCCCGGCCTG-3′。

1.3.2 PG测定 将静脉血样常规离心5 min，应用美康Mokosensor-A300 胶体金免疫分析仪进行分析。

1.4 评价标准 PG诊断采用根据国内高发区胃癌筛查标准[4]：PGⅠ浓度≤70 μ/L且PGⅠ/PGⅡ≤7.0。miRNA表达量以2.72作为临界值[5]。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0统计学软件处理数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验；应用受试者工作特征曲线下面积评估诊断的敏感度及特异度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血浆miRNA-92a和PG表达情况 胃癌组血浆miRNA-92a表达量高于慢性萎缩性胃炎组和非萎缩性胃炎组，慢性非萎缩性胃炎组血浆miRNA-92a表达量低于慢性萎缩性胃炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组血浆 PGⅠ表达量和PGⅠ/PGⅡ低于慢性萎缩性胃炎组和慢性非萎缩性胃炎组，慢性萎缩性胃炎组PGⅠ/PGⅡ低于慢性非萎缩性胃炎组，差异有统计学意义(P<0.05)；慢性萎缩性胃炎和慢性非萎缩性胃炎PGⅠ表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 miRNA-92a联合胃蛋白酶筛查胃癌结果 miRNA-92a对胃癌诊断的敏感度和特异度分别为85.70%和70.8%，PG对胃癌诊断的敏感度和特异度分别为75.80%和84.90%，而miRNA-92a联合PG诊断胃癌及癌前病变的敏感度和特异度分别为86.49%和89.32%。

表1 血浆中miRNA-92a和PG表达情况Table 1 Expression of miRNA-92a and PG in plasma

*P<0.05与胃癌组比较 #P<0.05与慢性萎缩性胃炎组比较(SNK-q检验)

3 讨 论

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，虽然近年来远端胃癌的发病率有逐年下降的趋势，但近端胃癌的发病率却呈逐年上升的趋势。我国胃癌的发病率及病死率均为世界平均水平的2倍，死亡例数占所有癌症死亡例数的1/4。日本及欧美国家早期胃癌的诊断率较高，而我国早期胃癌的诊断率仅为20%左右，除了提高内镜下早期胃癌的识别率，寻找一种简单、可靠、敏感及特异度较高的诊断方法成为临床上急需解决的问题。

目前胃癌的筛查方法较多，包括血清学检查、影像学检查、内镜检查等。随着技术的进步，早期筛查的手段不断更新，诊断的敏感度及特异度有所提高，但仍存在一定局限性，临床上仍以内镜+病理组织学检查作为诊断的金标准。我国作为胃癌的高发国，人口众多，整个人群进行内镜筛查难度大，且费用高；另外，内镜检查较为痛苦，也限制了其临床应用。因此，一种准确度高、痛苦小、费用低的检查手段成为临床亟待解决的问题。

PG检测作为早期胃癌血清学筛查方法，已经在临床上普遍应用。PG是由胃黏膜腺体分泌并参与消化吸收的一种蛋白酶前体，根据PG电泳迁移率可分为7个组分：较快移向阳性的1～5组分的免疫原性近似，称为PGⅠ，主要存在于胃体、胃底腺的主细胞和颈黏液细胞；组分6～7被称为PGⅡ，主要存在于胃体、胃窦及十二指肠上段的Brunner腺。PG几乎由胃内产生，因此PGⅠ、PGⅡ的变化主要反映了胃黏膜腺体的数量及分泌功能[6]。PG经过细胞分泌后除大部分直接进入人体消化道外，约1% PG透过胃黏膜毛细血管进入血液系统，从而能够从血液中检出。因此，通过血清中PG的变化可以间接判断胃黏膜的情况。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是慢性胃炎的主要致病因子，感染H.pylori时，PGⅠ和PGⅡ分泌均增加；但如果发现萎缩性胃炎时，PGⅠ含量下降；当出现肠上皮化生、上皮内瘤变或胃癌时，PGⅠ分泌减少，PGⅠ/PGⅡ也会发生变化[7]。众所周知，胃癌的发生发展遵循着正常黏膜→炎症反应→萎缩→肠上皮化生→上皮内瘤变→恶性肿瘤的过程[8]。而PG表达水平的变化可以充分反映胃癌发展的各个阶段，具有胃黏膜“血清学活组织检查”的价值。

单独应用PG筛查胃癌的敏感度及特异度并不理想，主要是由于PG受到胃癌组织学因素的影响。中老年群体、男性患者容易发生肠型胃癌，PG浓度水平的变化可以直接反映胃黏膜肠化、萎缩的情况，对胃癌诊断及治疗具有重要的参考价值；但年轻胃癌患者，多以遗传易感性等宿主因素为主，PG的作用有限，并且在贲门癌患者中，其腺体类型与远端胃的腺体类型不完全相同，故PG也并不能充分反映贲门黏膜病变的情况[9]。随着研究的深入，近年来应用PG联合H.pyloriIgG抗体的方法筛查胃癌，已经取得了令人瞩目的成绩，并将PG联合H.pylori抗体检测的方法(ABC法)列为指南推荐的胃癌筛查手段。而近期的研究发现，“ABC”法也存在一定的局限性，尤其在“ABC”法中A组的(H.pylori抗体阴性PG阴性)人群发病风险应该很低，但研究发现仍有大约10%胃癌患者发生于该组[10]。分析原因主要与筛查人群服用质子泵抑制剂和抗H.pylori治疗造成结果的假阴性有关，故对于既往应用质子泵抑制剂及既往根除H.Pylori人群应进行重点的筛查。但如何能够寻找一种不受上述因素影响的方法也显得尤为重要。

miRNA是一类大约有22个核苷酸组织的单链非编码的小分子RNA，参与多个生理活动过程的调控。miRNA可以通过调控细胞的增殖、凋亡、分化、迁移等功能影响肿瘤的发生和发展，不同的miRNA在肿瘤的不同阶段呈现不同的表达量，故在肿瘤的筛查、诊断、治疗等方面有着巨大的潜力[11]。miRNA种类繁多，有的通过正性调控，促进细胞的增殖、抑制凋亡、加速分化来影响肿瘤发生发展，也有的对肿瘤起负性调控作用。miRNA-92a是miRNA-17-92基因促编码的7个miRNA之一，位于人类基因组第13号染色体，目前的研究显示其与多种肿瘤密切相关[12-17]。Tanaka等[18]对7例白血病患者血清中的miRNA进行分析，发现148种表达量不同的miRNA，其中miRNA-92a及miRNA-638表达量差异最大，建议miRNA-92a作为白血病诊断的血清学标记物。亦有临床研究发现，miRNA-92a在结直肠组织中呈高表达情况，并且与肿瘤的分期及预后密切相关[19]。王秀等[20]进一步研究发现，在结直肠癌中miRNA-92可通过抑制PTEN基因来促进肿瘤细胞的增殖、抑制凋亡。而Conev等[21]研究发现miRNA-92a亦作为结肠癌化疗后复发的重要指标，尤其对于出现结外淋巴结转移的诊断敏感度及特异度分别为85.7%和90.9%。有关miRNA-92a在胃内中的研究较少。李红[22]研究发现miRNA-92a可作为内源性调节因子作用于胃黏膜上皮细胞，可通过负性调控Foxd1的表达，介导CDX2的表达上调，从而促进胃黏膜肠上皮化生的发生，证实miRNA-92a参与肠上皮化生，基于此推断miRNA-92a可通过促进胃黏膜肠上皮化生进而导致肠型胃癌的发生。本研究结果显示，胃癌患者血浆中miRNA-92a呈高表达，miRNA-92a诊断胃癌的敏感度及特异度分别为85.7%和70.8%；进一步联合PG监测，诊断胃癌的敏感度和特异度分别86.4%和89.32%。

本研究结果还显示，胃癌组PG及PGⅠ/PGⅡ明显低于慢性非萎缩性胃炎和慢性萎缩性胃炎组，而胃癌组mRNA-92表达量明显高于其他2组。PG主要反映的是胃黏膜腺体的功能状态，而miRNA主要提示微观水平的变化，不受药物及其他因素的干扰，因此两者联合监测，其敏感度及特异度均高于80%，可以作为理想的筛查手段。由于本研究样本量较少，miRNA-92a的临界值尚有待进一步验证，故下一步研究将扩大样本量，进一步修正miRNA-92a临界值，并验证miRNA-92a联合PG在胃癌筛查中的作用。

总之，寻找诊断敏感度和特异度高、费用少且无创伤的胃癌早期诊断标志物，有助于胃癌的早期发现和早期诊断。而miRNA-92a联合PG则可能成为一种非侵入性、指导胃癌早期诊断的血清学诊断标志物。

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(本文编辑：赵丽洁)

The diagnostic value of miRNA-92a combined with micro pepsinogen in gastric carcinoma

NIU Wei-wei, YANG Chun-chun, DUAN Zhi-ying, HUO Xiao-hui
(DepartmentofGastroenterology，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050031，China)

Objective To investigate the value of microRNA-92a combined with pepsinogen(PG) in the diagnosis of gastric carcinoma. Methods Sixty cases of gastric cancer, 141 cases of chronic atrophic gastritis and 162 cases of chronic non-atrophic gastritis were adopted，using real-time PCR assay for detection of micro RNA-92a and using immune colloidal gold technique for measuring PG. The sensitivity and specificity of miRNA-92a, PG and miRNA-92a combined with PG in the diagnosis of gastric cancer were calculated respectively. Results The expression of miRNA-92a in chronic atrophic gastritis group and non atrophic gastritis group was lower than gastric cancer group. The expression level of plasma miRNA-92a in chronic non atrophic gastritis group was lower than chronic atrophic gastritis group(P<0.05). The expression level of PG Ⅰ and PG Ⅰ/PGⅡ in gastric cancer group were lower than chronic atrophic gastritis group and chronic non atrophic gastritis group. The value of PG Ⅰ/PGⅡ in chronic atrophic gastritis group was lower than non atrophic gastritis group(P<0.05). There was not significant between chronic atrophic gastritis and chronic atrophic gastritis group(P>0.05). microRNA-92a sensitivity in the diagnosis of gastric cancer and specificity were 85.70% and 70.8%. PG in sensitivity and specificity in the diagnosis of gastric cancer were 75.80% and 84.90%. The sensitivity of micro RNA-92a combined with PG diagnosis of gastric cancer and precancerous lesion and the specificity was 86.49%, the specificity was 89.32%. Conclusion micro RNA-92a combined with PG was better than single detection in diagnosis of gastric cancer.

stomach neoplasms； microRNAs； pepsinogen

2017-02-27；

2017-03-08

河北省医学科学研究重点课题(ZD20140221)

牛巍巍(1981-),男,河北南宫人，河北医科大学第一医院主治医师，医学博士研究生，从事消化内科疾病诊治研究。

R735.2

A

1007-3205(2017)06-0638-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.06.005