牛樟芝和沉水樟芝的物种同源性及质量控制研究

王宏运，王宫，喻琳，褚克丹，徐伟，李煌

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省中医药研究院，福建 福州 350003

牛樟芝和沉水樟芝的物种同源性及质量控制研究

王宏运1，王宫2，喻琳1，褚克丹1，徐伟1，李煌1

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省中医药研究院，福建 福州 350003

目的 比较研究牛樟芝和沉水樟芝药材间的物种同源性，进行质量控制研究。方法 建立牛樟芝和沉水樟芝药材的 HPLC 指纹图谱，采用 Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），乙腈-1%甲酸水为流动相梯度洗脱，流速 0.8 m L/m in，检测波长 254 nm，柱温 30 ℃。结果 牛樟芝和沉水樟芝的 HPLC指纹图谱中标定了 9 个共有峰，11 批牛樟芝相似度在 0.906～0.995 之间，10 批沉水樟芝相似度在 0.956～0.998之间。结论 本法简便、重复性好，牛樟芝和沉水樟芝的 HPLC 指纹图谱和红外光谱具有一定相似性。

牛樟芝；指纹图谱；高效液相色谱法

牛樟芝 Antrodia Cinnamomea 又名樟芝、樟菇等，属于多孔菌科，寄生于牛樟树 Cinnamomum kanehirae hayata 的腐朽内壁。其产于我国台湾省，是一种珍贵的药用真菌。《中国药用真菌图志》记载，牛樟芝具有抑肿瘤、抗氧化、消炎等功效[1]。研究表明，牛樟芝主要含三萜、多糖、腺苷等成分[2]，具有降糖[3]、保肝[4-5]、缓解疲劳[6]等功效。但自然界中牛樟树被大量砍伐，以至濒临绝种，被列为台湾保育类树种，且野生牛樟芝对生长环境要求苛刻，生长速度缓慢，因而产量较低。近年来有人工培育牛樟芝技术的出现，其中段木培养法所得产物与野生牛樟芝成分最为相似[2，7-9]，但段木栽培法也会受到其寄主牛樟树资源数量的限制。沉水樟芝是选择沉水樟 Cinnamomum micranthum 作为樟芝的新宿主，经人工培育得到。沉水樟主要分布于我国台湾、福建、广东、广西、湖南、江西及越南北部等地，资源数量相对比较丰富。本研究运用HPLC指纹图谱和红外光谱分析牛樟芝与沉水樟芝的相似性，探讨二者物种的同源性，并进行质量控制。

1 仪器与试药

Ultimate 3000 高效液相色谱仪，Thermo Fisher Scientific；Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），DIKMA 公司；电子分析天平，METTLER TOLEDO；KQ-500DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；冷冻干燥机，CHRIST；傅里叶变换红外光谱仪，Thermo Fisher Scientific。

乙腈、甲酸均为色谱纯。牛樟芝和沉水樟芝样品来源信息见表 1，经福建省中医药研究院王宫副研究员鉴定为多孔菌科牛樟芝 Antrodia Cinnamomea 和沉水樟芝 Antrodia Cinnamomea 的干燥子实体，样品保存在福建中医药大学中药检定中心。

表 1 牛樟芝和沉水樟芝样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 µm）；检测波长：254 nm；流速：0.8 m L/min；柱温：30 ℃；进样浓度：20 mg/m L；进样量：10 μL；采集时间：80 m in；流动相为乙腈-1%甲酸水，梯度洗脱程序见表2。

表 2 流动相梯度洗脱程序（%）

2.2 供试品溶液的制备

取牛樟芝样品粉末约 0.6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入 95%乙醇 9 m L，超声提取 40 min（功率 500 W，频率 40 kHz），过滤，滤渣再加 95%乙醇9 m L，同法提取 2 次，合并滤液，置于 60 ℃水浴锅内挥干溶剂，残渣用 95%乙醇溶解，转移至 10 m L 容量瓶中，加 95%乙醇至刻度，摇匀，取 1 m L 定容后的溶液，加入 95%乙醇 2 m L，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。同法制备沉水樟芝供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 分别取同一批牛樟芝（N1）和沉水樟芝（C1）的供试品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6次，检测特征指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD 均小于 3.0%，符合指纹图谱技术要求。

2.3.2 稳定性试验 分别取同一批牛樟芝（N1）和沉水樟芝（C1）的供试品溶液，按“2.1”项下条件，分别在 0、2、4、8、12、24 h 检测特征指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD 均小于 3.0%，说明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.3.3 重复性试验 分别取同一批牛樟芝（N1）和沉水樟芝（C1）样品，按“2.2”项下方法操作，制备 6 份供试品溶液，按“2.1”项下条件进样，检测特征指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD 均小于 3.0%，符合要求。

2.4 样品测定

分别将 11 批牛樟芝样品和 10 批沉水樟芝样品按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样检测，记录色谱图，见图 1、图 2。

图 1 11 批牛樟芝 HPLC 指纹图谱叠加图

图 2 10 批沉水樟芝 HPLC 指纹图谱叠加图

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 共有峰的确认 根据11批牛樟芝供试品溶液HPLC 指纹图谱给出的参数，通过比较，其中 10 个峰为各批样品共有。确定这 10个峰为不同批牛樟芝的共有峰，见图 3。同理，确定 11 个峰为不同批沉水樟芝的共有峰，见图 4。对比牛樟芝和沉水樟芝的指纹图谱发现：沉水樟芝极少含有图3中7号峰，牛樟芝极少含有图 4 中 3’、4’号峰，将 3 个无法比较的峰除去，2种樟芝样品得到9个共有峰。

图 3 牛樟芝对照图谱

图 4 沉水樟芝对照图谱

2.5.2 牛樟芝和沉水樟芝指纹图谱相似度评价 在“2.1”项色谱条件下建立 11 批牛樟芝和 10 批沉水樟芝的 HPLC 指纹图谱，将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2012 版》软件，建立牛樟芝和沉水樟芝指纹图谱的共有模式图（图 3、图 4）。以共有模式图作为对照指纹图谱，计算 11 批牛樟芝与对照指纹图谱的相似度以及 10批沉水樟芝与对照指纹图谱的相似度，结果见表3。

表 3 11 批牛樟芝、10 批沉水樟芝与其对照指纹图谱的相似度

2.6 红外光谱分析

2.6.1 样品制备 将牛樟芝、沉水樟芝样品按“2.2”项下方法进行提取操作，提取液用冷冻干燥机干燥，过 100 目筛；溴化钾研细，过 100 目筛。将样品和溴化钾放烘箱干燥至恒重。

2.6.2 扫描图谱 将样品粉末与溴化钾粉末混合（溴化钾与样品用量之比为 100∶3），放入玛瑙研钵研磨，压片。扫描条件：光谱测量范围 400～4000 cm-1，扫描次数 16 次，OPD 速度 0.2 cm-1/s，扫描样品压片后立即采集背景。获得样品的红外光谱图，见图5。

2.6.3 结果分析 从红外光谱图看，牛樟芝和沉水樟芝并无明显差别，主要区别在 1675～1500 cm-1处，由 C=C、C=N 的伸缩振动引起。推测牛樟芝和沉水樟芝所含化学基团种类基本相同。

3 讨论

本试验考察了水、甲醇、95%乙醇作为样品提取溶剂并参考相关文献[10]，结果 95%乙醇的提取率最高，最终选择 95%乙醇作为提取溶剂。

本试验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-1%甲酸水和乙腈-1%甲酸水 4 个流动相系统。结果发现，采用乙腈-1%甲酸水流动相系统，各峰的分离度相对良好，基线较平稳，因此最终采用乙腈-1%甲酸水系统作为流动相系统。试验记录 200 m in 的色谱峰，考察80 min 后的色谱峰情况，结果 80 m in 后的图谱中还有 3 个色谱峰出现，保留时间分别为 92、103、135 m in，但峰面积小，并且均在 10以内，对整体色谱情况影响很小，为缩短检测时间决定舍弃。

通过对色谱峰紫外区进行全波长扫描发现，在254 nm 处呈现的色谱峰最多，且各色谱峰吸收良好，分离效果佳，因此选择 254 nm 作为检测波长。

11 批牛樟芝相似度在 0.906～0.995 之间，10 批沉水樟芝相似度在 0.956 ～0.998 之间， 相 似度 均在0.9～1.0 之间，符合制定指纹图谱的条件，其中沉水樟芝质量相对更为稳定。因牛樟芝目前尚未列入《中华人民共和国药典》，市面上也缺少相应的对照品，自行制备对照品成本过高，故本试验暂不对其具体成分进行定性和定量。通过对各批牛樟芝和沉水樟芝样品指纹图谱以及相应对照指纹图谱的比较发现，虽然2种樟芝寄主有所不同，但色谱峰的种类基本相同。两者相同保留时间的色谱峰比较，在进样量相同的情况下牛樟芝样品各色谱峰的峰面积普遍大于沉水樟芝样品对应色谱峰的峰面积，唯有牛樟芝样品 3、4号峰例外，峰面积略小于或大致等于对应沉水樟芝的5 ’、 6 ’ 号 峰 。 2 种 樟 芝 属 于 同 一 物 种 Antrodia Cinnamomea，推测牛樟芝所含化学成分大部分为沉水樟芝所含有，但有些成分含量相对较少，有些成分含量大致相等。

牛樟芝因对生长环境要求苛刻、生长缓慢等原因导致资源稀缺。牛樟芝药效学实验研究显示其可以抗炎[11]、抑制肿瘤细胞生长[12]。尽管牛樟芝具有多种有益功效，但是受到资源数量的限制而不能得到广泛应用。从本研究的指纹图谱来看，沉水樟芝含有的色谱峰数量、保留时间与牛樟芝几乎一致，仅峰面积有所不同，说明沉水樟芝与牛樟芝具有较大的相似性。并且牛樟芝和沉水樟芝本是同一物种，沉水樟芝是以沉水樟代替牛樟树作为其寄主。沉水樟芝能否作为牛樟芝的替代品，还需在有效成分及药效学方面进行进一步的研究。

[1] 戴玉成,图力古尔,崔宝凯,等.中国药用真菌图志[M].哈尔滨：东北林业大学出版社,2012：564-565.

[2] 张远腾,李晓波.牛樟芝化学成分及其药理作用研究进展[J].中草药, 2016,47(6)：1034-1042.

[3] 王宫,王瑾.樟芝降血糖试验研究[J].海峡药学,2015,27(6)：34-35.

[4] 刘典谟.牛樟芝滴丸保肝功效及药代动力学研究[D].成都：成都中医药大学,2012.

[5] 王瑾,徐财泉,王宫.牛樟芝浓缩胶囊对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用[J].现代中药研究与实践,2014,28(5)：44-46.

[6] 王瑾,王光磊,王宫.牛樟芝缓解体力疲劳作用的实验研究[J].中国现代药物应用,2014,8(14)：246-247.

[7] 蔡为明,金群力,蔡青松,等.牛樟芝人工培养及活性成分与药理作用的研究进展[J].食药用菌,2015,23(1)：17-23.

[8] 杨璐,黄正明.牛樟芝研究进展[C]//中国医药教育论坛-中国医药教育协会第三届三次理事大会暨学术年会论文专辑,2013：228-232.

[9] 张知晓,季梅,泽桑梓.牛樟芝培养技术的研究进展[J].热带农业科学, 2015,35(3)：94-99.

[10] 王宫,王瑾,徐蔚.牛樟芝总三萜提取工艺研究[J].现代中药研究与实践,2011,25(6)：67-68,

[11] HSIEH Y H, CHU F H, WANG Y S, et al. Ant rocamphin A, an anti-inf lammatory principal f rom the f ruiting body of Taiwanofungus camphoratus, and its mechanisms[J]. J Agric Food Chem,2010,58(5)：3153-3158.

[12] PENG C C, CHEN K C, PENG R Y, et al. Antrodia camphorata ext ract induces replicative senescence in super ficial TCC, and inhibits the absolute migration capabi lity in invasive bladder carcinoma cel ls[J]. J Ethnopharmacol,2007,109(1)：93-103.

Study on Species Homology and Quality Control of Two K inds of Antrodia Cinnamomea

WANG Hong-yun1, WANG Gong2, YU Lin1, CHU Ke-dan1, XU Wei1, LI Huang1(1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China)

Objective To compare and study species homology of two kinds of Antrodia Cinnamomea; To conduct the study on quality control. Methods HPLC fingerprint of two kinds of Antrodia Cinnamomea was applied. The HPLC fingerprints were determined on an Diamonsil C18 (2) column (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) eluted With the mobile phase consisting of 1% formic acid solution and acetonitrile in gradient mode at a flow rate of 0.8 m L/min; the detection wavelength was set at 254 nm; the column temperature was 30 ℃. Results There were 9 common peaks in the HPLC fingerprints of Antrodia Cinnamomea. The similarities varied from 0.906 to 0.995 and from 0.956 to 0.998 in 11 batches and 10 batches of two kinds of Antrodia Cinnamomea, respectively. Conclusion The method is simple and With good reproducibility, which shows that the HPLC fingerprint and infrared spectrum share sim ilarity for two kindsof Antrodia Cinnamomea.

Antrodia Cinnamomea; fingerprint; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.019

R284.1

A

1005-5304(2017)08-0085-04

2016-11-28）

（

2017-02-20；编辑：陈静）

福建省战略性新兴产业发展专项（2013 年）

徐伟，E-mai l：xwf j tcm@sina.com