蕨麻多糖提取纯化及生物活性研究进展

沈蓉，刘迪生，侯晨晨，刘迪，程菊，白德成

1.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000

蕨麻多糖提取纯化及生物活性研究进展

沈蓉1，刘迪生2，侯晨晨1，刘迪1，程菊1，白德成1

1.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000

蕨麻为传统中药，且为藏医常用草药，主要分布于我国甘肃、青海、西藏等地。蕨麻多糖是蕨麻的多种活性成分之一，近年来国内外学者对其进行了初步研究，显示其具有抗氧化、抗衰老、抗菌、调节免疫、调节血糖等多种功效。本文对近年蕨麻多糖的提取、纯化、生物活性研究进行综述，为深入研究及开发利用提供思路。

蕨麻多糖；提取；纯化；生物活性；综述

蕨麻为蔷薇科植物鹅绒委陵菜属植物蕨麻Potentilla anserina L.的块根。藏名又称戳玛、卓老洒曾、延寿草、仙人果等。主要产于我国华北、东北和西北等地，遍布于海拔500～4100 m山坡草地及草甸。《新华本草纲要》载青藏高原产蕨麻块根发育最良。蕨麻因根块膨大、富含淀粉，产地居民常将其用于日常饮食，认为具有滋补作用，食之益人。蕨麻性甘、味温，可养阴生津、益胃健脾、益补血气，兼止血、止泻、止咳功效，能治妇人崩中、下血、吐血、痈疮疟疾、脾虚腹泻、下痢等[1]。藏医学著作《月王药诊》载治“小肠出血，干燥，粘连胃壁，眼不闭合之症”；《四部医典》亦记载蕨麻治疗出血症及脾胃虚弱等疾病。近年来，蕨麻在中医临床上也有广泛应用，如治疗狼疮性肾炎、慢性肾功能衰竭、大病初愈身体虚弱等。因此，蕨麻具有较高的食用和药用价值。

蕨麻含有多种化学成分，如多糖、萜类、酚类、黄酮类等[2-4]，其中蕨麻多糖具有明确的生物学活性，可发挥抗氧化应激、抗衰老、调节免疫、抗炎、抗菌等多方面的药理作用。本文就蕨麻多糖的提取、纯化及其生物活性进行整理，为蕨麻开发利用及后续研究提供参考。

1 提取工艺

蕨麻多糖有多种提取方法，一般用水、稀盐或稀碱溶液提取得到粗多糖，酸性条件下温度过高易引起糖苷键断裂，故也可采用复合酶热水浸提法。

常见提取方法为水提醇沉法。将蕨麻粉碎，石油醚等有机溶剂脱脂，按一定液料比加入蒸馏水，沸水浴中提取一段时间，取上清液加入乙醇或甲醇沉淀，过夜后离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥，制得蕨麻粗多糖。此方法将温度、时间、料液比作为单因素条件，分别测定不同条件下蕨麻多糖的提取率，以确定适合蕨麻多糖提取的最佳工艺条件。通过3种单因素正交试验和极差分析，提取温度为 90 ℃，时间为 1 h，料液比为 1∶15，多糖的提取率为 5.72%±0.37%[5]。该方法 3 种因素中料液比对提取率影响最大，其次是时间、温度，故选择适宜的料液比至关重要。随着料液比的提高，多糖得率出现先升后降的现象；随着温度的升高，多糖向提取液的传质速率增加，黏度逐渐降低，有利于组织中多糖浸出，但温度过高会导致多糖降解甚至失活。因此，采用不同的方法所得到的多糖浓度及组分也有差异。

丁耀光等[6]利用索氏提取法和超声波辅助提取法提取蕨麻粗多糖后纯化，苯酚-硫酸法测定多糖含量并绘制标准曲线。结果表明，索氏提取法多糖含量为14.34 mg/g，超声波辅助提取法蕨麻多糖含量高达24.25 mg/g。

王峰等[7]以水为溶剂，微波辅助提取蕨麻多糖，得到最佳工艺条件为液固比 3、浸提温度 90 ℃、浸提时间 120 min，Sevage 法除蛋白后蕨麻多糖平均含量可达 83.9 mg/kg。

高丹丹等[8]建立了蕨麻多糖的提取率数学模型，用 Box-Behnken 中心组合试验设计原理优化提取工艺。采用水提醇沉法提取蕨麻粗多糖，以丙酮、乙醚除去杂质，分析多糖的最佳提取调件为液料比（m L/g）20.3∶1、浸提时间 4.4 h、温度 82 ℃，蕨麻多糖提取率可达 24.53%±0.24%。

陈炼红等[9]用复合酶水解法提取蕨麻多糖，在单因素试验的基础上对复合酶配比和提取工艺进行正交试验。结果表明，纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶三种酶的最佳酶配比及酶解时间为 60 m in，复合酶法提取法的优化工艺条件为料液比 1∶30、pH 值 4.5、温度 45 ℃，蕨麻多糖得率为 8.12%，优于常规水提法。

2 纯化工艺

提取得到的蕨麻粗多糖为多种单糖、蛋白质、色素等的混合物，杂质存在增加了多糖的吸湿性，其所带电荷可吸附大量其他杂质，使杂质去除变得更为困难。此外，蛋白质吸附多糖，增加了多糖的分级、分离难度。故不能以通常化合物的纯度标准来衡量，需经纯化、分离才能得到一定分子量范围的均一组分即纯品多糖。

脱蛋白主要方法有酶法、Sevage 法、酶法＋Sevage 法。酶法根据酶解时间、pH 值、酶用量、酶解温度4个单因素确定工艺条件，以脱蛋白率和多糖提取率为主要评价指标。该法符合对多糖组成、结构、功能的研究需要，操作条件较平稳，能较好保持多糖活性，避免使用有机试剂产生的危害。Sevage 法是在蕨麻粗多糖溶液中，加一定体积 Sevage 试剂（氯仿与正丁醇按一定比例混合），充分混匀后静置一段时间，于分液漏斗中分层后弃去下层有机溶剂层及中间的蛋白质层。需反复多次方能达到较好的脱蛋白质效果，故除单因素外，还需考虑次数对脱蛋白效果的影响。该法以蛋白质的去除率为主要评价指标，较好的脱蛋白工艺为静置 10 m in、摇振 30 m in、氯仿∶正丁醇（V/V）5∶1、料液比 1∶1[10]。酶法＋Sevage 法是使用最优方案酶法和 Sevage 法相结合的脱蛋白法，在蛋白酶最佳工艺条件下，可提高蕨麻多糖脱蛋白率、降低损失率。

纯化的蕨麻多糖呈白色，但因提取方法缺陷和植物组织成分复杂性，提取的蕨麻多糖液多呈褐色、黄色或红色，对其分离、纯化、定量、定性、结构测定、药效实验均有较大影响。因此，脱色在蕨麻多糖纯化过程中也十分重要。常用脱色方法有活性炭法和树脂吸附法。活性炭可吸附芳香族有机物，对不带电荷的物质吸附力较强，而对带电荷的物质吸附力较弱；树脂吸附法采用的树脂理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，不受盐类及低分子化合物的影响，可有选择地吸附有机物质。

纯化后的蕨麻多糖由多种单糖成分组成，可用超离心、高压电泳、层析及高效液相色谱法等分析各组分。刘春兰等[11]采用水提法提取蕨麻粗多糖后，以酶法脱淀粉及蛋白，经纸层析及高效液相色谱分析，得出蕨麻多糖组分包括阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，为酸性杂多糖。夏莲等[12]用毛细管电泳分析法，以 1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮作柱前衍生剂，水提醇沉并经 Savage 法脱蛋白后，从蕨麻多糖中精细分离出9种单糖组分，其中阿拉伯糖、半乳糖及半乳糖醛酸含量最高，其次为葡萄糖、鼠李糖及葡萄糖醛酸，木糖、甘露糖及岩藻糖含量较低。

3 生物活性

中药的多糖成分作为中药新药开发的重要方向之一，受到学者关注，其生物活性及药理作用机制也成为研究热点。蕨麻多糖生物活性主要体现在抗氧化应激、抗衰老、免疫调节、抗菌等方面。

3.1 抗氧化及衰老

蕨麻多糖可通过清除 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟自由基对抗氧化应激，降低细胞内活性氧及自由基水平，从而抑制细胞凋亡[13]。采用必需微量元素硒修饰蕨麻多糖，硒化修饰的蕨麻多糖体外抗氧化能力及自由基清除率可显著提高[14]。

韦薇等[15]建立新生 SD 鼠心肌细胞缺氧损伤模型，观察不同浓度蕨麻多糖对心肌细胞损伤的保护作用；建立小鼠常压缺氧模型，予不同浓度蕨麻多糖灌胃。结果表明，蕨麻多糖能明显降低心肌细胞乳酸脱氢酶漏出、改善心肌细胞活力可提高缺氧小鼠存活率、延长生存时间。

张永慧等[16]建立大鼠脑缺血再灌注模型，术前连续予蕨麻多糖 7 d。结果表明，蕨麻多糖能明显改善缺血再灌注引起的神经系统功能缺失、降低脑组织炎症因子丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子-α 及白细胞介素（IL）-1β 含量，提高脑组织抗氧化能力。

研究表明，予蕨麻多糖后采用过氧化氢诱导小鼠脾脏淋巴细胞凋亡，能明显改善脾淋巴细胞氧化损伤、减少细胞内凋亡小体形成，在一定范围内呈剂量依赖性[17]。低浓度蕨麻水提物可呈剂量依赖性清除DPPH 自由基，抑制肌纤维细胞 IL-6 产生，对细胞骨架纤维肌动蛋白及人结肠细胞内细胞因子的表达均有一定的调节作用[18]。此外，蕨麻水提取物可增加小鼠脑、肝及血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低 MDA 水平，提高脑内 Na+-K+-ATP酶水平，延缓 D-半乳糖所致衰老，改善学习记忆能力[19]。

3.2 调节免疫

免疫系统具有重要的防御屏障作用，免疫功能低下将导致机体内环境的稳定性下降、易感性增加。用环磷酰胺诱导 BALB/c 小鼠免疫抑制模型，予蕨麻多糖连续预处理 5 d 再予环磷酰胺，可缓解环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠胸腺及脾脏组织萎缩，改善免疫抑制剂对组织超微结构的影响，促进脾淋巴细胞增殖，活化单核-巨噬细胞系统，刺激吞噬细胞吞噬功能的发挥，改善血清炎症因子 IL-10、干扰素-γ（IFN-γ）水平，显著提高免疫抑制小鼠的免疫功能[20-21]。不同浓度的蕨麻多糖可改善急性低剂量镉染毒小鼠的脾、胸腺指数，增加 CD3+、CD4+的脾淋巴细胞数目，促进镉染毒小鼠脾淋巴细胞分泌 IFN-γ及可溶性淋巴细胞活化基因-3[22]。体外实验表明，蕨麻多糖可通过激活鸟苷酸环化酶提高小鼠脾淋巴细胞内环磷酸鸟苷水平，从而发挥免疫调节作用，还可升高细胞内 Ca2+水平、影响蛋白激酶C信号通路、活化淋巴细胞，对细胞内花生四烯酸信号分子的表达亦有调节作用[23]。此外，蕨麻多糖可提高大鼠运动能力，抑制运动性免疫机能低下的发生，加速运动后的机体恢复[24]。因此，蕨麻多糖对机体的免疫功能具有明显的调节作用。

3.3 抗菌

蕨麻多糖的抗菌作用屡有报道。Tomczyk M 等[25]研究发现，蕨麻水提物对幽门螺旋杆菌有明显的抑制作用，且对革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）也有一定的抑制作用，但对革兰氏阴性菌无明显抑制作用。郝博慧[5]研究表明，0.5%蕨麻多糖可抑制志贺菌，抑制时间可达 24 h，1%、3%蕨麻多糖可分别抑制大肠杆菌和沙门氏菌，抑制时间可达 8 h。此外，蕨麻水提物对 6 种食品污染菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、志贺菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌）均有一定的抑制作

用[26-27]。

3.4 调节血糖

研究表明，蕨麻多糖具有伏格列波糖、阿卡波糖样作用，可抑制 α-葡萄糖苷酶的纯酶活性，提示可能具有延缓单糖吸收、降低餐后高血糖的作用[28]。夏勇等[29]连续予四氧嘧啶高血糖模型小鼠蕨麻及麦冬混合水提物（剂量为 3 g/kg）30 d，模型组空腹血糖明显改善，且糖耐量随提取物剂量增加呈增高的趋势，提示蕨麻及麦冬混合提取多糖对高血糖小鼠血糖有调节作用。

3.5 其他

此外，蕨麻多糖可改善四氯化碳诱导的急性肝损伤，明显降低血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平，改善肝功能、降低肝脏的脂质过氧化[30]。

陈修红等[27]研究表明，蕨麻水提物除抑菌作用外还可明显抑制人肝癌细胞 HepG2 的活性及体外增殖，提示可能具有潜在的抗肿瘤活性。

Guo T 等[31]研究表明，蕨麻多糖具有镇咳祛痰的作用，可降低化学刺激引起的小鼠气道痉挛，减少咳嗽频率。

4 展望

随着对蕨麻研究的深入，蕨麻多糖的成分及生物活性已逐渐成为研究热点。蕨麻多糖因其多种生物活性，具有广阔的研究和开发前景。目前，蕨麻提取及生物活性相关研究较多，但多运用蕨麻提取物的混合组分，该类混合物除多糖外，还含有萜类、黄酮类、酚类等多种成分，故不能说明蕨麻多糖作用；此外，蕨麻多糖具体有效成分及其作用机制尚不明确；同时，由于原材料及提取方法等方面的局限性，蕨麻多糖的化学成分存在差异，尚缺乏标准化研究。因此，为充分开发蕨麻多糖药用价值，其研究还有待于进一步深入。

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Research Progress in Extraction, Purification and Bioactivities of Potentilla Anserine Polysaccharide

SHEN Rong1, LIU Di-sheng2, HOU Chen-chen1, LIU Di1, CHENG Ju1, BAI De-cheng1(1. School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. The First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

As a common Tibetan medicine, Potentilla anserine L. is a kind of important Chinese materia medica, which is mainly distributed in Gansu, Qinghai and Tibet Provinces. As the active constituent from Potentilla anserine L., potentilla anserine polysaccharide has

initial research by researchers in abroad and at home. It is suggested that potentilla anserine polysaccharide exhibits various functions including antioxidation, anti-aging, immunoregulation, inhibiting bacteria and anti-diabetic. This article reviewed the research on extraction, purification and bioactivities of potentilla anserine polysaccharide, which is expected to provide ideas for the further study and research and development.

potentilla anserine polysaccharide; extraction; purification; bioactivities; review

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.031

R284.2；R285.5

A

1005-5304(2017)08-0125-04

2016-06-27）

（

2016-07-15；编辑：向宇雁）

甘肃省中小企业创新基金（1205FCCA27）；中央高校基本科研业务费专项基金（lzujbky-2016-61）

白德成，E-mail：bdc@lzu.edu.cn