实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

冯育芳，王莎莎，邢 进，付 瑞，巩 薇，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

冯育芳，王莎莎，邢 进，付 瑞，巩 薇，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050)

目的 为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏，并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法 根据空肠弯曲菌的HipO区域、沙门菌的inV区域和志贺菌的ipaH区域设计特异性引物和探针，并进行单病原定量PCR检测验证；后分析多重PCR的灵敏度和特异性，并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果 本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线；该方法的灵敏度为1×103ng/μL；特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论 该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。

实验树鼩；空肠弯曲菌；沙门氏菌；志贺菌；多重定量PCR；

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)，是弯曲杆菌属的一种，是近十年来受到国内外广泛重视的人畜共患病原菌[1]。沙门氏菌(Salmonella)也是一种在公共卫生学上具有重要意义的，常见的人畜共患病的病原菌，广泛分布于自然界[2]。志贺氏菌(Shigella)是人类细菌性痢疾的病原体，主要引起急性直肠结肠炎和痢疾[3]。空弯、沙门和志贺均属于肠道病原菌，对人和动物都可以致病，引起的症状也很类似，三种菌都可引起急性肠炎和食物中毒症状[4]，为实验动物需要排除的病原体。

树鼩作为新型的实验动物，来源于自然环境，其实验动物化首先要排除人兽共患病[5]，如空弯、沙门和志贺等肠道病原菌。为了提高日常检测的效率，适应送检单位的需求，满足国际交流与合作的需要，急需建立同时检测这三种菌的多重PCR方法，为保证实验动物微生物检测质量提供技术支撑。同时，为了提高检测方法的灵敏度和特异性，本研究拟建立多重荧光定量PCR方法，用于实验树鼩空肠弯曲杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检测。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：本实验所用菌种、编号及来源见表1。

1.1.2 样本：随机抽取了56份树鼩肠道样本，全部进行了沙门、志贺和空弯菌的检测。

1.1.3 引物：根据沙门氏菌的inV区域、志贺菌的ipaH区域和空肠弯曲菌的HipO区域，分别设计了探针和引物，序列见表2

1.1.4 标准品：根据3种菌的特异基因序列，由Takara公司进行质粒制备，将制备的质粒作为本实验的标准品。

1.1.5 所用试剂：Qiagen DNA提取试剂盒(51304，54161)购自凯杰企业管理(上海)有限公司。OXIOD哥伦比亚血琼脂(CM0031B)、OXIOD胰蛋白胨大豆琼脂(CM00131B)、胰蛋白胨大豆肉汤(CM0129B)、BD公司SS琼脂(212118)、OXIOD XLD培养基(CM0469B)以及添加剂(SR0109E)均购自北京兰伯瑞生物技术有限公司。Takara Probe qPCR Mix(RR391A)购自北京六合通经贸有限公司。

1.1.6 仪器设备：所用PCR仪为美国ABI 7500 fast Real-Time PCR仪；微量分光光度计为美国Thermo Nanodrop 2000；自动核酸提取仪为德国Qiagen QIAcube；德国Hettich 22R冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 空弯、沙门和志贺菌的培养：参照国标GB/T 14926.1-2001、GB/T 14926.47-2001和GB/T 14926.49-2001中的方法进行培养。

表1 实验用菌株

表2 多重定量PCR实验所用引物序列

1.2.2 模板DNA的提取：沙门菌、志贺菌和空弯菌等21株参考菌株用Qiagen DNA提取试剂盒，按照使用说明提取基因组DNA。经微量分光光度计检测，所提取的细菌DNA浓度均不低于50 ng/μL。

1.2.3 PCR体系和反应条件：PCR反应体系为20.4 μL，包括：Mix 10 μL，Rox II 0.4 μL，沙门探针+引物1 μL，空弯、志贺引物及探针各1 μL，模板DNA 3 μL，见表3。94℃ 5 min；94℃ 30 sec，58℃ 30 min，72℃ 1.5 min，共35个循环；72℃ 7 min。

表3 PCR反应体系

根据上述体系对待检样本DNA进行Real-Time PCR检测，同时设置标准品阳性对照和阴性对照。

反应条件为95℃预变性30 s；然后95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环，在每个循环延伸结束时进行荧光信号检测。

1.2.4 特异性检测：用所建立的Real-time PCR体系分别扩增肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、啮齿类柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌等来检测所建方法的特异性。

1.2.5 敏感性检测：将合成的标准品质粒浓度进行换算，得出质粒的拷贝数均为1×1011copies/μL数量级，将1010copies/μL浓度的质粒按1:1:1合并，并做10倍系列稀释至101copies/μL，分别为1010copies/μL、109copies/μL、108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL，同时设置阴性对照，检测所建方法的敏感性。

1.2.6 应用：用所建立的real-time PCR检测方法对树鼩的56份粪便样本进行检测。

2 结果

为建立实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重定量PCR方法，首先需要分别设计针对3种细菌的PCR引物和探针，以及合适的PCR体系和扩增条件，为此，本研究首先分别设计了针对3种细菌的PCR引物和探针，并进行单细菌实时荧光定量PCR检测，以检测所有的定量PCR的实验要素，包括引物对、探针、实验体系及扩增条件等。

2.1 空肠弯曲菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法建立

本研究测试了针对空肠弯曲菌的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法，结果显示，该real-time PCR能有效地扩增空肠弯曲菌标准品，其检测灵敏度下限为1×102copies/μL(图1A)。该扩增标准曲线的斜率为-3.391，相关系数为0.999，扩增效率为97.196%(图1B)。用所建立的real-time PCR方法扩增表1中除空弯之外的12株菌，结果见图1C，所测样品均未见扩增，说明该体系特异性良好。此外，使用该方法对空肠弯曲菌进行了扩增，可得到特异性扩增，结果见图1D。上述结果说明，本研究的实验要素可用于空肠弯曲菌的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR扩增。

2.2 沙门氏菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法建立

本研究测试了针对沙门氏菌的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法，结果显示，该real-time PCR能有效地扩增沙门氏菌标准品，其检测灵敏度下限为1×102copies/μL(图2A)。该扩增标准曲线的斜率为-3.39，相关系数为1，扩增效率为97.247%(图2B)。用所建立的real-time PCR方法扩增表1中除沙门氏菌之外的12株菌，结果见图2C，所测样品均未见扩增，说明该体系特异性良好。此外，使用该方法对本实验室的9株空肠弯曲菌进行了扩增，均可得到特异性扩增，只是菌株间载量存在差异，结果见图2D。上述结果说明，本研究的实验要素可用于沙门氏菌的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR扩增。

2 志贺菌TaqMan实时荧光定量PCR方法建立3

首先，本研究测试了针对志贺菌的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法，结果显示，该real-timePCR能有效地扩增志贺菌标准品，其检测灵敏度下限为1×102copies/μL(图3A)。该扩增标准曲线的斜率为-3.316，相关系数为0.999，扩增效率为100.244%(图3B)。用所建立的real-time PCR方法扩增表1中除沙门氏菌之外的11株菌，结果见图3C，所测样品均未见扩增，说明该体系特异性良好。此外，使用该方法对本实验室的痢疾志贺菌和宋内志贺菌进行了扩增，均可得到特异性扩增，只是菌株间载量存在差异，结果见图3D。上述结果说明，本研究的实验要素可用于志贺菌的TaqMan实时荧光定量PCR扩增。

A: 空肠弯曲菌Real-time PCR方法敏感性结果(图中曲线上所标数字的单位为copies/μL)；B: 空肠弯曲菌real-time PCR方法标准曲线；C: 空肠弯曲菌real-time PCR方法特异性结果；D: 对空弯菌种扩增的结果图1 图1 空肠弯曲菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法建立A: Sensitivity of the real-time PCR for Campylobacter jejuni (copies/μL); B: Standard curve of the real-time PCR for Campylobacter jejuni; C: Specificity of the real-time PCR for Campylobacter jejuni; D: Results of amplification of the Campylobacter jejuni strainFig.1 Establishment of the TaqMan-MGB real-time PCR for Campylobacter jejuni.

4 三重TaqMan实时荧光定量PCR方法建立

在建立空弯、沙门及志贺菌单菌实时荧光定量PCR方法后，本研究把3种细菌引物和探针混合尝试建立三重TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示，该real-time PCR能有效地扩增空弯、沙门及志贺菌标准品，其检测灵敏度下限为1×103copies/μL(图4A)。该扩增中空弯标准曲线的斜率为-3.387，相关系数为1，扩增效率为97.354%；沙门标准曲线的斜率为-3.263，相关系数为1，扩增效率为102.528%；志贺标准曲线的斜率为-3.294，相关系数为1，扩增效率为101.175%(图4B)。用所建立的real-time PCR方法扩增表1中除空弯、沙门及志贺菌之外的9株菌，结果见图4C，所测样品均未见扩增，说明该体系特异性良好。上述结果说明，本研究成功建立三重TaqMan实时荧光定量PCR方法。

之后，用本实验所建立的real-time PCR方法对56份树鼩肠道样本进行检测，结果显示，空弯有5份样本阳性(空弯单重有7份阳性，培养有5份阳性)，志贺有4份样本阳性(志贺单重有5份阳性，培养有4份阳性)，沙门检测无阳性，结果见图4D。本研究建立的三重TaqMan实时荧光定量PCR方法与经典的细菌培养检测法结果一致，说明本方法具有较好的灵敏性和特异性。

A: 沙门氏菌Real-time PCR方法敏感性结果(图中曲线上所标数字的单位为copies/μL)；B: 沙门氏菌Real-time PCR方法标准曲线；C: 沙门氏菌Real-time PCR方法特异性结果；D: 对沙门氏菌种扩增的结果图2 沙门氏菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法建立A: Sensitivity of the real-time PCR for Salmonella (copies/μL); B: Standard curve of the real-time PCR for Salmonella; C: Specificity of the real-time PCR for Salmonella; D: Results of amplification of the Salmonella speciesFig.2 Established of TaqMan-MGB real-time PCR for Salmonella.

A: 志贺菌real-time PCR方法敏感性结果(图中曲线上所标数字的单位为copies/μL)；B: 志贺菌real-time PCR方法标准曲线；C: 志贺菌real-time PCR方法特异性结果；D: 对志贺菌种扩增的结果图3 志贺菌TaqMan实时荧光定量PCR方法建立A: Sensitivity of the real-time PCR for Shigella (copies/μL); B: Standard curve of the real-time PCR for Shigella; C: Specificity of the real-time PCR for Shigella; D: Results of amplification of the Shigella speciesFig.3 Established of the TaqMan-MGB real-time PCR for Shigella.

5 结论

空肠弯曲杆菌主要可引起人体急性肠炎和食物中毒，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利综合症等免疫性损伤性疾病。也可引起动物流产不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎。沙门氏菌不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒、鼠伤寒、动物流产、死亡等，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎、感染性腹泻和食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位。志贺氏菌是人类细菌性痢疾的病原体之一，主要引起急性直肠结肠炎和痢疾。空弯、沙门和志贺均属于肠道病原菌，对人和动物都可以致病，引起的症状也很类似，三种菌都可引起急性肠炎和食物中毒症状[6]。

唐梦君等人建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法，用于家禽泄殖腔样本的检测[7]。阳成波等人先后建立基于SYBR Green I或TaqMan探针的real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌[8, 9]。刘俊华等[10]人建立实时荧光PCR快速检测食品中的空肠弯曲菌。孔繁德等[11]人进行了沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制，并进行了初步应用。郑友限等人建立实时荧光定量PCR法用于沙门菌的检验，用鼠伤寒标准菌和60份食品样本进行检测方法的特异性、敏感性和重复性试验，并与常规法和科玛嘉平板分离法做比较[12]。赵雪涛等人也建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法[12]。陈峰等人利用二聚体蝎型荧光探针法，建立检测志贺菌的荧光定量PCR技术，可应用于食品卫生监管以及传染病诊断等[13]。高春燕等人建立一种检测志贺菌属快速敏感的荧光定量PCR方法。

为方便快速检测，也有部分联合检测方法的建立，如王晨等人建立了沙门菌和志贺菌二联实时荧光PCR检测方法，实验结果与权威检验机构的结果符合率达100%，适用于CDC体检等同时对沙门菌和志贺菌的快速临床检测[14]。陈萍等人基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法，该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。石晓路等[15]人建立改良分子信标-多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。于新芬等[16]人建立多重实时荧光 PCR 检测沙门菌侵袭蛋白A 基因(invA)、肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素基因(elt)、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因(ipaH)的方法，可用于临床腹泻粪便标本的快速筛检。但未见空弯、沙门和志贺三种肠道病原菌的荧光定量PCR检测方法的建立，而且上述检测都是针对临床样品或食品检测，与本研究针对的实验树鼩存在一定的差异。

本研究通过引物、探针的设计，及实验体系、扩增条件的优化，成功建立了沙门志贺空弯菌多重qPCR检测方法，所建方法特异性良好，敏感性可以检测到1×103copies/μL(与单重比低一个数量级)，而且特异性好，对非目标菌株未见阳性扩增。并对该方法进行了初步的应用，其中56份树鼩样本中空弯有5个阳性，志贺有4个阳性，沙门无阳性，与分离培养相比检测结果完全一致，与单重荧光定量比略低，但是多重可以节省检测试剂，节约检测时间。因此，该多重PCR方法在实验动物微生物检测具有很好的应用和推广前景。

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Establishment of a multiplex real-time PCR method for quantitative detection ofCampylobacterjejuni,SalmonellaandShigellain tree shrews

FENG Yu-fang, WANG Sha-sha, XING Jin, FU Ru-in, GONG Wei, YUE Bing-fei

(Institute for Laboratory Animal Resources, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To establish a rapid, simple, sensitive, and specific multiplex real-time PCR method for quantitative detection ofCampylobacterjejuni,SalmonellaandShigellain tree shrews. Methods Specific primers and probes were designed, according to the HipO gene ofCampylobacterjejuni, inV gene ofSalmonellaand ipaH gene ofShigella. The primers were confirmed by single pathogen quantitative PCR, and the sensitivity and specificity of the multiplex PCR were analyzed. Finall, the samples of experimental tree shrews were detected by this multiplex PCR method. Results The PCR element of TaqMan-MGB real-time PCR assay was able to quantitatively amplify theCampylobacterjejuni,SalmonellaorShigella. Appropriate standard amplification curves ofCampylobacterjejuni,SalmonellaandShigellain the multiplex quantitative PCR were obtained. The sensitivity of this method was 1×103ng/μL. There was no false positive detection from other bacterial strains. Conclusions This multiplex quantitative real-time PCR method has good application and development prospects in the detection of microorganisms in tree shrews.

Tree shrew;Campylobacterjejuni;Salmonella;Shigella; Multiplex Real-time PCR, Quantitative detection

国家科技支撑计划项目(编号：2014BAI01B01)。

冯育芳(1981-)，女，硕士，副研究员，研究方向：实验动物细菌学。E-mail: fyf307@126.com。

岳秉飞(1960-)，男，博士，研究员，研究方向：实验动物遗传学。E-mail: y6784@126.com。

技术方法

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0056-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.012

2016-11-29