小鼠皮肤心脏联合移植模型的建立及移植物功能监测

胡 钰，吴大威，翟秀宇，陈 默，王远涛*

(1.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院 泌尿外二科)

小鼠皮肤心脏联合移植模型的建立及移植物功能监测

胡 钰1，吴大威2，翟秀宇2，陈 默2，王远涛2*

(1.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院 泌尿外二科)

目的 探讨小鼠皮肤心脏联合移植模型的建立及移植物功能的监测。方法 以BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠做为供、受者，单纯皮肤移植组采用尾-背法行皮肤移植，单纯心脏移植组采用腹腔异位心脏移植法行心脏移植，皮肤心脏联合移植组序贯采用尾-背皮肤移植及腹腔异位心脏移植模型。术后采用腹部触诊的方法，监测心脏移植物功能，通过观察残存移植皮片大小，监测皮肤移植物功能。结果 皮肤心脏联合移植组皮肤移植物存活时间较单纯皮肤移植组略有延长(皮肤心脏联合移植物v.s.单纯皮肤移植组，8天v.s.7天)，但两组皮肤移植物存活时间比较没有显著差别(P=0.1290)。单纯心脏移植组心脏移植物和皮肤心脏联合移植组心脏移植物平均存活时间均为9天(MST=9天)，两组心脏移植物存活时间无显著差别(P=0.6077)。结论 小鼠皮肤心脏联合移植模型稳定，移植物功能监测简单方便，适用于移植免疫学方面的研究。

移植；模型；小鼠

(ChinJLabDiagn,2017,21:1256)

随着分子生物学技术的发展，出现了各种转基因和基因敲除小鼠，为研究移植免疫反应提供了更多的工具。1973年Corry等[1]建立了小鼠腹部心脏移植模型，因其属于血管化器官移植模型，排斥反应强度中等，术后监测简便，且小鼠具有品系较纯、试剂来源广、免疫学检测方便等优点，现已广泛应用于移植免疫学研究中。而小鼠皮肤移植模型是研究免疫排斥反应的基本方法之一[2]，皮肤移植物内有含有较多的树突状细胞，因此最容易发生快速且严重的排斥反应，所以在移植免疫学研究中常用皮肤移植来检测排斥或耐受[3]。本实验借鉴了原有的皮肤及心脏移植手术技术，建立了小鼠皮肤心脏联合移植模型，没有增加手术难度，结果稳定，移植物功能监测简便，为移植免疫学研究提供了一种新的小鼠模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

C57BL/6小鼠60只,BALB/C小鼠45只，均为雌性，约6-8周龄,体重约20 g左右，所有试验用小鼠均来源于吉林大学第一医院动物实验中心。单纯皮肤移植组：BALB/C小鼠5只作为供体，C57BL/C小鼠20只作受体，单纯行尾-背皮肤移植；单纯心脏移植组：BALB/C小鼠20只作为供体，C57BL/C小鼠20只作受体，单纯行腹部异位心脏移植。皮肤心脏联合移植组：BALB/C小鼠20只作为供体，C57BL/C小鼠20只作受体，先行尾-背皮肤移植后，立即行腹部异位心脏移植。

1.2 手术器械及试剂

手术显微镜一台购于日本徕卡公司;显微手术器械购于德国Roboz公司;10-0血管缝合线购自美国Ethicon;其他丝线均购自上海医用缝合线厂;油沙条购于美国 Gauze，邦迪创可贴购于美国Johnson。水合氯醛及肝素由吉林大学基础医学院提供。

1.3 小鼠腹部异位心脏移植方法

1.3.1 供心制备 麻醉采取4%水合氯醛(10-12 μl/g) 腹腔注射。供鼠麻醉成功后,供鼠取仰卧位，四肢向外伸展后用3M贴固定于鼠板上。术区剃毛、消毒后，取剑突下至耻骨联合纵行切口进入腹腔,拨开肠管显露下腔静脉，并经下腔静脉注入1%肝素盐水0.3 ml肝素化，剪断腹主动脉并向上剪开胸骨、膈肌，暴露心脏。6-0丝线结扎下腔静脉，集束结扎右肺门处脉管后去除右肺。于肺动脉分叉处横断；30G细针穿刺升主动脉，以10 ml冰盐水灌洗心脏，并于头臂干分支处切断主动脉。集束结扎心脏周围剩余脉管。取下供心并置于4℃冰盐水中保存备用。

1.3.2 受体手术 受鼠麻醉后固定于鼠板。术区剃毛、消毒后，经腹正中切口进入腹腔。向右上推开肠管,并用湿盐水纱布覆盖，充分显露肾动静脉至髂血管水平的下腔静脉及腹主动脉。血管夹同时阻断下腔静脉及腹主动脉，分别于腹主动脉及下腔静脉做纵行切口，切口长度与供心主动脉及肺动脉宽度一致，采用两点固定，连续缝合。吻合完毕后,缓慢松开血管夹，棉签轻触心脏，促进供心复跳。关闭腹腔，腹部切口丝线连续缝合，受鼠置于灯下保温至苏醒。术后不限食水。

1.3.3 移植心功能监测 术后第3天开始行腹部移植心触诊，根据移植心跳动由强到弱分为4-0级，每日记录，以指尖不能触及移植心跳动作为移植心排斥的时间。

1.3.4 小鼠尾-背皮肤移植方法 切取供鼠尾巴，纵行剖开，取尾部全层皮肤，制备成大小约1×1 cm2的皮片备用。麻醉后受鼠背部剃毛，并剪掉与备用皮片相等大小的背部全层皮肤，5-0丝线四角固定移植皮片，油纱布覆盖皮片，邦迪创可贴将油纱布固定。3天后拆除创可贴，观察移植皮片存活情况，皮肤移植物排斥早期会在移植皮片上出现溃疡、坏死，部分融合成片，随后坏死的部分皮肤出现干燥、结痂，当残存正常的移植皮片小于原皮片的20%时判定为排斥。

1.3.5 小鼠皮肤心脏联合移植方法 受鼠先行尾-背皮肤移植，随后翻身即刻行腹部异位心脏移植，具体方法同前描述。

2 结果

2.1 一般手术情况

本研究单纯皮肤移植组共行皮肤移植20例，术后1例因小鼠自身撕咬导致移植物脱落，手术成功率为95%(19/20)，手术时间为5.15±0.27 min；单纯心脏移植组共行手术20例，其中1例术中复跳不佳，1例出现吻合口出血，手术成功率为90%(18/20)，手术时间为57.60±1.38 min；皮肤心脏联合移植组共完成手术20例，其中1例术中出现心脏移植物吻合口出血，1例出现麻醉意外，手术成功率为90%(18/20)，手术时间为62.10±1.66 min，与单纯心脏移植组比较，两组手术时间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 皮肤移植物存活情况

单纯皮肤移植组皮肤移植物MST为7天，而皮肤心脏联合移植组皮肤移植物中位存活时间略有延长(MST=8天)，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)(见图1)。

图1 小鼠皮肤移植物存活曲线

2.3 心脏移植物存活情况

单纯心脏移植组和皮肤心脏联合移植组手术成功36例，术后5天开始两组心脏移植物均出现不同程度的搏动减弱，移植心体积增大，两组心脏移植物MST均为9天(见图2)，无统计学差异(P>0.05)。

图2 小鼠心脏移植物存活曲线

2.4 移植物病理结果

皮肤移植物排斥期间均可见移植皮片坏死、溃疡、结痂，HE染色显示残存的皮肤移植物组织层次及附属物结构不清，局部可见片状坏死及大量单核细胞浸润(见图3)。

图3 皮肤移植物HE染色结果

心脏移植物行H&E染色，观察移植心内炎性细胞浸润情况。可见心肌细胞排列紊乱，间质水肿，心脏移植物内可见大量单核细胞浸润(见图4)。

图4 心脏移植物HE染色结果

3 讨论

皮肤移植物中含有的兰格汉斯细胞，是一种抗原提呈能力很强的树突状细胞，能将抗原迅速提呈给受体效应性T细胞，主要通过Ⅰ类抗原提呈途径介导快速的皮肤移植物排斥反应，与其他血管化的大器官移植相比，小鼠皮肤移植发生的排斥反应更加快速而猛烈，因此，皮肤移植也是各类同种异体器官或组织移植中最难成功的。但皮肤移植操作相对简单，移植物存活观察方便，所以在移植免疫的实验研究中常用做首选的观察方法[4]。皮肤移植的方法很多，传统的背-背皮肤移植法需要将皮下组织去除，皮片处理花费时间较长；耳-背皮肤移植法操作简单，但皮片较小，数量有限。本研究采用的是尾-背皮肤移植法，一个供体尾部皮肤取材后可以给5个受体行皮肤移植，而且采用四角固定，邦迪创可贴覆盖，大大减少了由于受鼠自身撕咬造成的移植物脱落，本研究中皮肤移植40例，仅1例出现上述情况，成功率高，手术时间仅5分钟左右，速度快，效果满意。

而小鼠异位心脏移植属于血管化器官移植，更贴近临床器官移植，且主要通过Ⅱ类抗原提呈途径将移植物抗原提呈给受者效应性T细胞，现已被越来越多的应用于移植免疫的实验研究。以往由于设备、器械和技术条件所限，心脏移植模型更多采用颈部血管套管心脏移植，即使用自制套管将受鼠颈部血管与供心血管连接[5]，虽然无需外科精密的血管吻合技术，但由于颈部空间相对较小，且需使用套管，容易形成血栓，套管与连接处易折曲，影响供心血供，移植心触诊困难，这些都可以对实验结果造成影响，因此,目前国外大多推荐采用腹部异位移植模型[6]。本研究采用的为腹部异位心脏移植模型，40例心脏移植中仅3例出现外科情况导致失败，相比国内外相关研究，成功率高。

本研究还首次建立了皮肤心脏联合移植模型，皮肤心脏联合移植组与单纯心脏移植组的手术时间无明显差别，说明联合移植并没有增加移植的技术难度，并没有显著延长术者的操作时间。皮肤心脏联合移植组皮肤移植物排斥时间与单纯皮肤移植组比较略有延长但无统计学差异，说明移植物排斥可能与移植物的大小、体积有关[7]，联合移植组不仅要排斥皮肤移植物，还要排斥同源的心脏移植物，所需要的效应细胞数量巨大，所以造成效应细胞的相对不足，皮肤移植物排斥时间略延长。移植物病理提示出显著的皮肤及心脏移植物排斥反应，说明此联合移植模型完全适用于移植排斥反应的监测和相关研究。

因为皮肤移植和心脏移植抗原提呈的途径不尽相同，免疫反应的机理不同，可能对移植物的排斥反应、免疫耐受的诱导造成影响，而本研究中皮肤心脏联合移植模型的建立，为移植免疫学的实验研究建立了一个全新的模型，为研究者提供了一个新的选择，且技术难度不大，成功率高，移植物排斥反应监测简便，结果确切，值得推广。

[1]Corry RJ，Winn HJ，Russel PS．Primarily vaseularized allografts of hearts in mice．The role of H-2D．H-2K，and non-H-2 antigens in rejection[J]．Transplantation，1973，16(4)：343.

[2]Billingham RE,Medawar PB.The Technique of Free Skin Grafting in Mammals[J].J Exp Biol,1951,28:385.

[3]樊拥军，张凤蕴，张 飚，等.一种简单的小鼠皮肤移植方法[J]．哈尔滨医科大学学报，2000,34(5)：332.

[4]成 功，陈 明，孙则禹，等.建立小鼠皮肤移植排斥模型稳定获得记忆T细胞[J]．中国比较医学杂志,2008,18(4):32.

[5]Chen HA.New technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice[J].Transplantation,1991,52(6):1099.

[6]Demir Y,Chen Y,Metz C,et al.Cardiac allograft rejection in the absence of macrophage migration inhibitory factor[J].Transplantation,2003,76(1):244.

[7]Ulusal BG,Ulusal AE,Wei FC，et al.Allograft mass as a possible contributing factor to the skin transplant outcome[J].J Surg Res,2010,161(2):321.

Skin Plus Heart Transplantation In Mice And Graft Monitoring

HUYu,WUDa-wei,ZHAIXiu-yu,etal.

(DepartmentofPathology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore the technique of mouse skin plus heart transplantation and the function of graft monitoring.Methods Methods:BALB/C and C57BL/6 mice were used as donors and recipients,respectively.Skin only group:C57BL/6 recipients

tail skin from BALB/C donors.Heart only group:C57BL/6 recipients received heart grafts from BALB/C donors.Skin plus heart group:C57BL/6 recipients received heart and tail skin grafts from BALB/C donors at the same time.Heterotopic palpation was performed to monitor the function of heart graft after transplantation,the function of skin grafts were monitored by observing the size of surviving grafts.Results Median survival time (MST) of skin grafts in skin only group was 7 days,the skin grafts survival time have slightly longer compared to skin only group,but there were no significant difference(MST=8 days,P=0.1290).There were no significant difference of heart grafts survival time in both heats only group and skin plus heart group(MST=9 days,P=0.6077).Conclusion Skin plus heart transplantation procedure is stable to perform.Heterotopic palpation of hearts grafts and observing the size of skin grafts are simple to monitor the function of grafts.The skin plus heart transplantation model by using this procedure and monitoring protocol is useful for immunological research related to transplantation.

Transplantation;model;mouse

国家自然科学基金(81671574)

1007-4287(2017)07-1256-04

R654.2

A

胡钰，医学博士，主治医师。

2017-03-20)

*通讯作者