血清中miRNA对人胶质瘤细胞的影响及临床意义

李东阳,陈兴国,王 勇，王白石,罗 速

(1.天津市泰达医院,天津300457;2.天津医科大学中新生态城医院,天津300467;3.北华大学基础医学院,吉林 吉林132001)

血清中miRNA对人胶质瘤细胞的影响及临床意义

李东阳1,陈兴国1,王 勇1，王白石2*,罗 速3

(1.天津市泰达医院,天津300457;2.天津医科大学中新生态城医院,天津300467;3.北华大学基础医学院,吉林 吉林132001)

胶质瘤是颅内肿瘤之一，也是在中枢神经肿瘤中治疗效果最差的一种肿瘤[1]。据相关部门统计，在原发性恶性肿瘤中，恶性胶质瘤所占的比例高达75%以上，且有较高的发生率和死亡率，这使胶质瘤受到了广泛关注[2,3]。研究者对胶质瘤的分子生物学进行了大量的研究，他们发现，一些miRNA与胶质瘤的发生有密切的关系[4,5]。此后，对miRNA与胶质瘤的关系的研究受到了极大的关注。

miRNA是长度为19-25nt的小分子RNA，它不编码蛋白质，主要的特征是不具有开放阅读框，且有组织特异性、高度保守性和时序性[6,7]。近些年来，随着对miRNA的研究的不断深入，研究者发现血清或者是血浆中的miRNA能被用来作为识别肿瘤的标志物，这给后续对肿瘤的研究提供了方向[8,9]。研究显示，胶质瘤细胞中miR-222被敲除后，可抑制胶质瘤细胞的生长[10]，胶质瘤细胞被X射线照射后，miR-222的表达量增加，miR-222的表达量与胶质瘤细胞的生存率存在正相关[11]。目前，关于miR-222与胶质瘤的关系的研究大多在组织和细胞中进行，关于miR-222在胶质瘤患者血液中的表达情况的研究很少。本研究对miR-222在胶质瘤患者血液中的表达情况以及对胶质瘤细胞增殖凋亡进行研究。望为后续的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验标本及分组 实验组为我院60例经病理学证实患胶质瘤的病人，并根据病理切片结果分为高级胶质瘤患者和低级胶质瘤患者。对照组为20例经CT证实无任何肿瘤性疾病的正常人。实验组血液标本在手术前30 min采集外周静脉血，采集的血液标本放于-80摄氏度冰箱保存备用。

主要试剂和仪器 荧光定量聚合酶链反应试剂盒、逆转录试剂盒购自日本Takara，反义miR-222NC和反义miR-222由上海吉玛合成，MTT试剂盒购自美国MP公司，CO2培养箱购自日本SANYO公司，细胞仪购自美国MG公司，流式细胞仪购自美国B-D公司，荧光定量仪购自美国ABI公司。

1.2 RT-qPCR检测与人胶质瘤相关的miRNA的表达水平

选取已经被证实与人胶质瘤相关的miR-221，miR-222和miR-21作为研究对象。血液样本离心后取上清，利用提取RNA试剂盒提取RNA。紫外分光光度计记录RNA在260 nm和280 nm的吸光度，260 nm/280 nm的比值大于2.0被认为是合格的样品。将合格的样品根据反转录试剂盒操作说明反转录成cDNA，荧光定量PCR检测miR-221，miR-222和miR-21的表达量。

1.3 细胞的培养与转染

从-80℃冰箱中取出人胶质瘤细胞株U251，37℃融化后，将细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM 培养基中，37℃、5% CO2、95%空气饱和湿度条件下培养。将对数生长期的U251细胞接种于6孔板中，调整细胞浓度为3×106个/ml，置于 5% CO2含量、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养，观察细胞达到60%的融合后， 分别将反义miRNA-222NC组和反义miRNA-222组分别转染至细胞内，培养6h后更换新鲜培养基，继续培养48 h后进行细胞收集，用于后续试验。

1.4 RT-qPCR检测胶质瘤细胞miR-222的表达水平

依照RNA提取试剂盒说明书分别提取转染的反义miRNA-222NC转染组和反义miRNA-222转染组的人胶质瘤细胞株U251的总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度，利用反转录试剂盒反转录成cDNA。利用RT-qPCR检测胶质瘤细胞miR-222的表达水平。以U6为内参基因，每样样本设定4个技术重复。

1.5 miR-222对细胞增殖的影响

取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔细胞培养板中过夜培养，对照组采用常规培养，反义miR-222NC组和反义miR-222组转染到细胞内，37℃饱和湿度、5% CO2条件下作用12、24、36、48、72 h后，加入MTT溶液10 μl(5 mg/ml)，37℃条件下培养4 h，加入DMSO溶液100 μl震荡，待沉淀完全溶解后置于酶标仪测定OD值。

1.6 miR-222对细胞凋亡的影响

基因转染48 h后，用PBS调整待测细胞浓度为2×106个/ml，取1 ml细胞悬液至离心管中，4℃，1 000 rpm，离心10 min，弃上清，加入1 ml冰预冷的PBS 重悬细胞，再次离心弃上清，PBS重复洗涤一次，加入Binding Buffer 200 μl重悬细胞，分别加入5 μl Annexin-V和PI，充分混匀后避光环境中室温静置20 min，加缓冲液300 μl，用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 胶质瘤患者和正常人血液中miR-221，miR-222和miR-21的表达结果

如表1所示，高级胶质瘤患者血清中miR-221，miR-222和miR-21的相对表达量显著高于正常组(P<0.05)，低级胶质瘤患者血液中只有miR-21与正常组差异显著，不同级别的胶质瘤中miR-221，miR-222和miR-21的比较发现，高级胶质瘤患者血清中miR-221，miR-222和miR-21的相对表达量显著高于低级胶质瘤患者(P<0.05)。这提示这3种miRNA可作为判断肿瘤级别标注物。由于miR-222在胶质瘤患者血液中的相对表达量高于miR-221和miR-21，因此，选用miR-222作为后续的研究。

表1 胶质瘤患者和正常人血液中miR-221，miR-222和miR-21的相对表达量比较

正常人血清比较*P<0.05，与低级别的胶质瘤比较#P<0.05

2.2 转染后miR-222的表达

如表2所示，空白对照组、反义miRNA-222NC转染组和反义miRNA-222转染组的表达量分别为523.68±4.29、509.64±6.43和12.62±2.12。反义miRNA-222转染组细胞的表达量显著低于空白对照组(P<0.01)，反义miRNA-222NC转染组细胞的表达量与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05)。

表2 转染对miR-222各组细胞表达的影响

与空白对照组相比，**P<0.01

2.3 miRNA-222对胶质瘤细胞增殖的影响

各组细胞转染12、24、36、48、72 h后，经MTT法检测细胞增殖情况。结果如表3所示，随着时间的变化，反义miRNA-222转染组细胞增殖速度明显低于空白对照组和反义miRNA-222NC转染组(P<0.01)。提示下调miRNA-222的表达可抑制胶质瘤细胞U251的增殖。

表3 miRNA-222对胶质瘤细胞增殖的影响

与空白对照组相比，*P<0.01，与反义miRNA-222NC转染组相比，#P<0.01

2.4 miRNA-222对胶质瘤细胞凋亡的影响

转染后经PI/ Annexin-V双染色用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。如图1，空白对照组、反义miRNA-222NC转染组和反义miRNA-222转染组的凋亡率分别为3.21%、3.32%和24.36%，反义miRNA-222转染组的凋亡率高于另外两组，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 转染后各组细胞凋亡率的变化

3 讨论

胶质瘤是一种原发性恶性肿瘤，能对人的中枢系统造成严重的损伤[12]。迄今为止，对胶质瘤的治疗主要采用的方法是手术治疗辅以放疗，这虽然也取得了明显的效果，但高级胶质瘤患者的生存时间却很短[13]。一些研究表明，胶质瘤的生长速度取决于细胞生长和抗凋亡能力[14]，血液中的miRNA可作为判断肿瘤级别的标志物[15]。因此，我们从这两点出发，对于胶质瘤相关的miRNA的表达以及增殖凋亡进行了研究。

miRNA在肿瘤、癌症等许多疾病以及正常人的血清和血浆中都能通过定量检测到，而且疾病的病情和类型不同，在外周血液循环中所检测到的miRNA的种类和表达量也不同[16,17]。我们对已经证实与胶质瘤相关的miR-222、miR-221和miR-21在胶质瘤病人血清中的表达进行研究，结果显示，低级胶质瘤患者和高级胶质瘤患者的miR-222、miR-221和miR-21在血清中表达量要高于正常人，且这3种 miRNA在高级胶质瘤患者的血液中表达量显著高于低级胶质瘤患者，这说明这3个miRNA可作为检测胶质瘤级别的标志物，也说明这3个miRNA加速着恶性胶质瘤的进展。由于miR-222在高、低胶质瘤患者血液中的表达量高于miR-221和miR-21，因此选择miR-222作为后续的研究。

一些研究显示，miRNA与胶质瘤的生存、生长和凋亡有很大的关系[18,19]。研究表明，与正常组相比，miR-195在胶质瘤患者细胞中的水平明显下降，当上调miR-195的水平时，胶质瘤细胞的增殖受到抑制[20,21]。这说明对miRNA调控的相关机制进行研究，更有利于去发现miRNA在胶质瘤中发挥的作用。研究显示，miR-222对多种肿瘤细胞的增殖、凋亡有关，研究者将反义miR-222转染到肿瘤细胞内，促进了肿瘤细胞的凋亡[22,23]。鉴于此，本研究使用同样的方法将反义miR-222转染到胶质瘤细胞中，检测对胶质瘤细胞的影响，结果显示，转染后反义miR-222转染组细胞的增殖情况显著低于反义miR-222 NC转染组和空白对照组，其凋亡率也显著高于另外两组，这提示miR-222 与胶质瘤的发生有很大的关系。

[1]陈卫峰,吴倩岚,莫立根.高级别脑胶质瘤术后 3D-CRT 与替莫唑胺同步放化疗 Meta 分析[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(7):543.

[2]聂秀涛,金贵善,徐厚池,等.脑胶质瘤干细胞和血管关系的研究进展[J].中华神经外科杂志,2014,30(3):315.

[3]Cuddapah V A,Robel S,Watkins S,et al.A neurocentric perspective on glioma invasion[J].Nature Reviews Neuroscience,2014,15(7):455.

[4]Wick W,Weller M,Van Den Bent M,et al.MGMT testing [mdash] the challenges for biomarker-based glioma treatment[J].Nature Reviews Neurology,2014,10(7):372.

[5]李 斐,陈谦学,刘宝辉,等.神经生长因子和增殖细胞核抗原在人脑胶质瘤中的表达及意义[J].武汉大学学报:医学版,2015,36(3):386.

[6]Wilczynska A,Bushell M.The complexity of miRNA-mediated repression[J].Cell Death & Differentiation,2015,22(1):22.

[7]Kong W,He L,Richards E J,et al.Upregulation of miRNA-155 promotes tumour angiogenesis by targeting VHL and is associated with poor prognosis and triple-negative breast cancer[J].Oncogene,2014,33(6):679.

[8]胡俊庭,鲍蕴文,白 艳,等.肺癌患者血清 microRNA-21 表达临床意义探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(001):39.

[9]苗 旺,张秀峰,杨 欣,等.MicroRNA-195 调控肿瘤细胞生物学行为的研究进展[J].中华脑科疾病与康复杂志 (电子版),2014,4(2):58.

[10]Sedano C D,Sarnow P.Hepatitis C virus subverts liver-specific miR-222to protect the viral genome from exoribonuclease Xrn2[J].Cell host & microbe,2014,16(2):257.

[11]Ottosen S,Parsley TB,Yang L,et al.In vitro antiviral activity and preclinical and clinical resistance profile of miravirsen,a novel anti-hepatitis C virus therapeutic targeting the human factor miR-222[J].Antimicrobial agents and chemotherapy,2015,59(1):599.

[12]杨 洁,袁江伟,王玉祥,等.MGMT 基因甲基化水平与恶性胶质瘤细胞对烷化剂耐药性的相关性[J].中国老年学杂志,2015,35(07):1949.

[13]张超超,于凤波,黄海燕,等.新诊断胶质母细胞瘤的治疗进展[J].牡丹江医学院学报,2016,37(1):111.

[14]程世翔,衣泰龙,徐忠伟,等.神经突触核蛋白-γ 基因沉默对胶质瘤细胞 U87-MG 增殖与凋亡的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志,2015,24(11):961.

[15]王玉洲,李金媚,杨志雄.miR-133a 与肿瘤发生发展研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2016,30(4):313.

[16]方 蕾,金艺凤.miRNA 与肺癌的关系[J].辽宁医学院学报,2016,37(1):109.

[17]Vlachos IS,Paraskevopoulou MD,Karagkouni D,et al.DIANA-TarBase v7.0:indexing more than half a million experimentally supported miRNA:mRNA interactions[J].Nucleic acids research,2015,43(D1):D153.

[18]朱潇鹏.不同级别脑胶质瘤中差异 microRNA 的表达谱研究[D].第三军医大学,2015.

[19]陈亮宇,刘丽波,李新星,等.MiR-429 对人 U87 胶质瘤细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响及其作用机制[J].中国医科大学学报,2015,44(9):769.

[20]陈良榉,杨 明,陈 艳,等.miR-15b 在内皮细胞的功能及其与血管相关性疾病的关系[J].遗传,2015,37(2):121.

[21]Zheng D,Ma J,Yu Y,et al.Silencing of miR-195 reduces diabetic cardiomyopathy in C57BL/6 mice[J].Diabetologia,2015,58(8):1949.

[22]Liu X,Xiao J,Zhu H,et al.miR-222 is necessary for exercise-induced cardiac growth and protects against pathological cardiac remodeling[J].Cell metabolism,2015,21(4):584.

[23]Yang F,Wang W,Zhou C,et al.MiR-221/222 promote human glioma cell invasion and angiogenesis by targeting TIMP2[J].Tumor Biology,2015,36(5):3763.

国家863课题(编号2011AA02A11)

1007-4287(2017)07-1113-04

2017-02-15)

*通讯作者